[發明專利]人AQP10和SOX17基因甲基化位點的檢測和應用

有效

• 申請號: 201510546525.X
• 申請日: 2015-09-01
• 公開（公告）號: CN106480169B
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 楊小麗;張悅寧;李佳桐;劉坤;張成東;林志弟;顧愷龍
• 申請（專利權）人: 楊小麗
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明公開了肝癌相關的人AQP10基因和SOX17基因的甲基化位點及應用，特點是利用一種焦磷酸測序法定量檢測人AQP10基因特異性位點cg20713492和SOX17基因位點cg02919422的甲基化水平，設計了針對兩位點的上、下游PCR擴增引物和焦磷酸測序引物，其中一條擴增引物帶生物素標記。本發明在原發性肝細胞癌患者中篩查AQP10基因和SOX17基因的特異性位點，能對其甲基化水平進行快速準確的定量檢測。

技術領域

本研究涉及人AQP10(aquaporin 10，水通道蛋白10)基因和SOX17(SRY(sexdetermining region Y)-box 17，性別決定區Y框蛋白17)基因特異性DNA(脫氧核糖核酸)甲基化位點在肝癌中的甲基化定量信息的改變，具體是指應用焦磷酸測序技術發現AQP10基因特異性DNA甲基化位點(cg20713492)在肝癌中甲基化程度降低；SOX17基因特異性DNA甲基化位點(cg02919422)在肝癌中甲基化程度升高。這些為探索肝癌的發病機理，找到與診斷或治療相關的潛在標志物提供支持。

背景技術

肝細胞癌是世界范圍內的發病率為第六位的惡性腫瘤，而其致死率卻高達第三位。肝細胞癌的危險因素包括酗酒、肝炎病毒感染、黃曲霉素攝入以及環境污染等。但由于致病因素復雜、發病機制不明，肝細胞癌的診斷和治療都面臨巨大的挑戰。近年來的眾多研究表明，表觀遺傳因素在肝癌的發生發展中起到重要作用。DNA甲基化作為主要的表觀調控機制，是指DNA分子CpG二核苷酸上胞嘧啶環的5’碳原子由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)作為甲基供體產生的一種可逆的共價修飾。研究肝癌相關基因特異性位點甲基化的改變，有助于了解肝癌的發病機理，為肝癌的預防和治療提供有效的作用靶點。

AQP10基因位于1號染色體長臂2區1帶，是水通道家族(Aquaporin，AQP)中的成員，編碼蛋白位于細胞膜上，是上皮細胞吸收和排泄水、甘油、尿素等中性溶質的通道，與物質轉運和代謝息息相關。AQP10在十二指腸、空腸、回腸大量表達，促進水和甘油的吸收。甘油是重新合成三酰基甘油和葡萄糖重要底物，作為控制甘油進出細胞的調節器，水通道蛋白家族的失調與代謝性疾病關系密切，如肥胖癥、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝病，而后者為肝癌 的風險因素之一。目前對AQP10的研究鮮有涉及腫瘤領域，Martens JH等人發現全反式維甲酸處理的急性早幼粒白血病細胞NB4細胞株中，AQP10蛋白表達上調，可能涉及組蛋白乙酰化的表觀遺傳學過程。

SOX17基因位于8號染色體長臂12區23帶，已知參與胚胎發育調節，通過轉錄調控抑制Wnt信號通路。研究表明SOX17基因的廣泛甲基化在大腸腺瘤到癌的惡變過程中顯著增加；在乳腺癌血清中SOX17基因啟動子區甲基化提示不良預后。此外，SOX17通過影響性腺發育，導致生殖細胞成熟障礙，被認是生殖細胞癌的候選診斷標志物。目前未見該基因在肝癌中的相關報道。

發明內容

本發明提供了一種焦磷酸測序法定量檢測人AQP10基因和SOX17基因特異性位點的甲基化水平及特異性引物，利用該引物可以準確檢測人原發性肝細胞癌組織中特異性DNA位點的甲基化水平。

焦磷酸測序法定量檢測人AQP10基因和SOX17基因特異性位點甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶鏈式反應)引物和甲基化測序引物。其中，所述AQP10基因的PCR上游引物序列為：biotin-5′-ATTTGTTAGGATGGGGGAGGTTAG-3′，下游引物序列為：5′-TCCCTCTATCTACATAAACACACTATCAC-3′，甲基化測序引物序列為：5′-CTTTAAAACCATTAACTCAATTC-3′；SOX17基因的PCR上游引物序列為：5′-GTTATTAGGTAGGTTGGGGGTTT-3′，下游引物序列為：biotin-5′-ACCTACCCCCCTCCCCTCAA-3′，甲基化測序引物序列為：5′-TTTGGGTAAGTTGTAGATTAGAT-3′。