[發(fā)明專利]一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510545340.7
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105177064A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設計）人: 王莉
• 申請（專利權）人: 王莉
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝。

背景技術

富馬酸（Fumaricacid）作為一種重要的有機基本化工原料和大宗化工產(chǎn)品，廣泛應用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、增塑劑、食品添加劑等領域，具有重要的市場價值。同時，以富馬酸為原料可以進一步合成多種高價值衍生物，如富馬酸二甲酯（DMF）、富馬酸亞鐵等。另外，富馬酸作為一種重要的四碳平臺化合物，還可以通過酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、1,4-丁二醇、γ-丁內(nèi)酯和四氫呋喃等四碳化合物。

目前工業(yè)上生產(chǎn)富馬酸主要采用化學法，發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸并未實現(xiàn)工業(yè)化，其主要原因是原料費占富馬酸生產(chǎn)的很大一部分，降低原材料成本成為生物法制備富馬酸的唯一出路，目前生產(chǎn)富馬酸的菌主要是米根霉，為了降低原料成本，考慮利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)富馬酸，但是需要將淀粉質(zhì)原料通過液化和糖化轉(zhuǎn)化成葡萄糖后再利用，此工藝復雜，而且液化和糖化同樣增加了成本，目前，已有文獻報道，直接利用米根霉液化液進行同步糖化發(fā)酵富馬酸，雖然取得了好的效果，但是發(fā)酵過程中后期糖耗低，終點殘?zhí)呛扛撸瑥亩鴮е掳l(fā)酵能耗高、成本高，設備利用率低等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，利用低濃度的淀粉液化液分批發(fā)酵，在中后期再向發(fā)酵系統(tǒng)中補加一定的淀粉液化液和糖化酶，既避免了高初糖濃度對富馬酸發(fā)酵的抑制，又可解決后期因菌自身糖化酶活力降低導致糖耗低的問題，同時提高了菌種的利用率，糖酸轉(zhuǎn)化率和設備利用率，降低了生產(chǎn)成本。

為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是這樣的：一種發(fā)酵制備富馬酸的工藝，包括以下步驟：

1）將淀粉液化液加入種子罐中，同時添加尿素和無機鹽，調(diào)整pH至2.5-3.5，滅菌后接入米根霉孢子懸浮液，進行種子液培養(yǎng)；

2）將淀粉液化液加入發(fā)酵罐中，滅菌后接入經(jīng)步驟1）培養(yǎng)好的種子液，并向其中加入分消的碳酸鈣；

3）待發(fā)酵32-38h，將淀粉糖化液和糖化酶作為流加液以20-25mL/h的流加速度向發(fā)酵罐內(nèi)流加，流加液的總加入體積為初始發(fā)酵體積的10%-15%，其中，流加液中淀粉糖化液的總糖濃度為60-80g/L,糖化酶的酶活力為4.5×10^5-6.7×10⁵U/mL。

初糖總糖過高則抑制菌體生長，初糖總糖過低則菌體生長旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌體發(fā)酵前期產(chǎn)酸速率，因而所述的發(fā)酵罐中淀粉液化液的初始總糖濃度優(yōu)選為40-60g/L。

優(yōu)選地，所述的淀粉液化液的具體制備過程：淀粉質(zhì)原料與水以8-12%（w/v）的比例混合成糊狀后，加熱到70-80℃，加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800～1000U/g干淀粉質(zhì)原料，保溫10-20min后繼續(xù)加熱到90-95℃，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100℃煮沸5～10min，然后趁熱經(jīng)過3-4層紗布過濾，濾液冷卻后加水調(diào)整糖度。

優(yōu)選地，所述的淀粉糖化液的具體制備過程為：將淀粉液化液加熱至50—60℃，加入糖化酶，保溫4-5h，無水酒精檢驗無糊精存在后，繼續(xù)加熱至70-80℃，保溫10-30min，冷卻后加水調(diào)整糖度。

富馬酸的發(fā)酵需要的低氮的條件下進行，為了控制淀粉質(zhì)原料中的氮含量，所述的淀粉質(zhì)原料優(yōu)選自可溶性淀粉、玉米粉、脫胚玉米粉、木薯粉之中的一種或2種的組合。

優(yōu)選地，種子罐中淀粉液化液的總糖濃度為25-25g/L。

優(yōu)選地，尿素的添加量為2-2.5g/L。

優(yōu)選地，所述的無機鹽為KH₂PO4，MgSO₄·7H₂O，ZnSO₄和FeSO₄·7H₂O，濃度分別為0.5-0.6g/L，0.4-0.55g/L，0.08-0.15g/L，0.08-0.09g/L。

優(yōu)選地，種子液接種于發(fā)酵罐的接種量為10-15%。

通過研究發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)富馬酸的米根霉，其自身具有糖化酶，可直接利用淀粉質(zhì)原料的液化液來生產(chǎn)富馬酸，但是，由于米根霉自身的具備的糖化酶活力不高，在發(fā)酵中后期受到發(fā)酵產(chǎn)物的抑制，活力進一步下降，因而其利用淀粉質(zhì)原料液化液來生產(chǎn)富馬酸時，容易造成后期糖耗低，終點殘?zhí)呛扛摺?/p>

有益效果：