[發明專利]一種通用PCR引物對及其應用

有效

• 申請號: 201510542028.2
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN106701747B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 張紅發;劉振民;王淵龍;游春蘋
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 31283 上海弼興律師事務所
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種通用PCR引物對，其特征在于，其包括兩條寡核苷酸，其中一條的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，另一條的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，其中全簡并堿基N為選自A、G、C和T中的任一種。

2.一種PCR擴增DNA試劑盒，其特征在于，其包括如權利要求1所述通用PCR引物對。

3.如權利要求2所述PCR擴增DNA試劑盒，其特征在于，其還包括dNTP、氯化鎂溶液、PCR緩沖液和DNA聚合酶。

4.一種PCR擴增DNA的方法，其特征在于，其反應體系包括如權利要求1所述通用PCR引物對、0.2-2mmol/L dNTP、1.0-2.5mmol/L鎂離子、0.01-0.20U/μL DNA聚合酶和10-100ng/μL模板DNA，所述通用PCR引物對中的兩條引物的含量均為0.1-3μmol/L；所述PCR擴增DNA的方法包括以下步驟：

(1)90-99℃，變性3-10分鐘；

(2)90-99℃，變性10-60秒；

(3)45-60℃，退火10-60秒；

(4)65-75℃延伸1-5分鐘；

其中所述步驟(2)-(4)重復25-45個循環；

(5)65-75℃延伸3-15分鐘。

5.如權利要求4所述PCR擴增DNA的方法，其特征在于，其還包括步驟(6)：將所述步驟(5)的產物4℃保存。

6.如權利要求4所述PCR擴增DNA的方法，其特征在于，其反應體系包括：1μmol/L如權利要求1所述通用PCR引物對、0.5mmol/L dNTP、1.5mmol/L鎂離子、0.05U/μL Taq DNA聚合酶和10-100ng/μL模板DNA。

7.如權利要求4所述PCR擴增DNA的方法，其特征在于，其方法包括以下步驟：

(1)95℃，變性5分鐘；

(2)95℃，變性30秒；

(3)50℃，退火30秒；

(4)72℃延伸2分鐘；

其中所述步驟(2)-(4)重復30-35個循環；

(5)72℃延伸5分鐘；

(6)將所述步驟(5)的產物4℃保存。

8.一種檢測微生物的方法，其特征在于，其包括以下步驟：

(1)提取樣品中的微生物的基因組DNA；

(2)以所述步驟(1)所述微生物的基因組DNA作為模板，用如權利要求1所述的通用PCR引物對進行PCR擴增，得PCR產物；

(3)將所述步驟(2)所述PCR產物測序，將所得到的序列進行比對分析，

其中，所述比對分析為與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，分析被比對的序列與所述GenBank數據庫中的序列的同源性打分，根據所述同源性打分最高的序列確定微生物的種類。

9.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述樣品中的微生物為選自細菌、霉菌和酵母中的一種或多種；所述基因組DNA為用DNA提取試劑盒進行提??；所述步驟(2)中，所述PCR擴增的體系包括以下組分：所述通用PCR引物對、0.2-2mmol/L dNTP、1.5mmol/L鎂離子、0.05U/μL DNA聚合酶和10-100ng/μL模板DNA，所述通用PCR引物對中的兩條引物的含量均為1μmol/L；所述PCR擴增的步驟包括：1)90-99℃，變性5分鐘；2)90-99℃，變性30秒；3)45-60℃，退火30秒；4)65-75℃延伸2分鐘；其中所述步驟2)-4)重復25-45個循環；5)65-75℃延伸3-15分鐘。

10.如權利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述測序為一代測序或二代測序。