[發(fā)明專利]一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510540948.0
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN105087482B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;戚康藝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與使用方法。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，包括膠原蛋白膜和培養(yǎng)液。本發(fā)明利用膠原蛋白膜作為載體，配合有效的培養(yǎng)液，促進(jìn)了hUC?MSCs向角膜上皮細(xì)胞的分化。實(shí)驗(yàn)表明，將hUC?MSCs接種于膠原蛋白膜后以本發(fā)明所述的培養(yǎng)液誘導(dǎo)7天后hUC?MSCs分化率可達(dá)32％。而不采用膠原蛋白膜為載體的誘導(dǎo)的分化率僅為9.54％。說明采用膠原蛋白膜能夠顯著提高h(yuǎn)UC?MSCs向角膜細(xì)胞分化的效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與使用方法。

背景技術(shù)

健全的角膜上皮細(xì)胞是角膜抵御外界各種有害因素?fù)p傷的重要條件，結(jié)構(gòu)與功能健全的角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞再生的主要來源。多種致病因素，如：眼外傷、手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥、藥物毒性均可造成角膜緣損傷，造成角膜緣干細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致上皮細(xì)胞缺失，從而導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險。因此，通過體外培養(yǎng)獲得大量用于角膜修復(fù)的上皮細(xì)胞這一難題亟待解決。臨床研究表明，通過體外培養(yǎng)自體角膜緣干細(xì)胞作為角膜上皮修復(fù)的種子細(xì)胞取得了良好療效。但是，自體角膜緣干細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)所要求的培養(yǎng)液成分復(fù)雜，細(xì)胞不穩(wěn)定易分化，細(xì)胞不能持續(xù)擴(kuò)增，細(xì)胞表型發(fā)生改變，所以每次移植都要在患者或其家屬的正常角膜上取下部分角膜緣組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，操作繁瑣，且給患者帶來二次痛苦，并且有研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)取供眼角膜緣組織大于三分之二時，將造成健眼的眼表疾病和視力不可逆的下降，使得大多數(shù)患者難以接受。因此，非常有必要尋找新的自體和異體移植的細(xì)胞來源。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)具有的低污染、來源充足、增殖旺盛等優(yōu)點(diǎn)，并且，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不受任何倫理及法理限制，因而吸引了眾多的研究者。但是，體外誘導(dǎo)hUC-MSCs向角膜上皮細(xì)胞分化十分困難。

細(xì)胞固定化技術(shù)可較好地保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞對機(jī)械和化學(xué)環(huán)境所造成壓力的耐受性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng),提高目的產(chǎn)物產(chǎn)率。用膜作為固定化的載體具有系統(tǒng)穩(wěn)定、操作簡便、經(jīng)濟(jì)廉價等優(yōu)點(diǎn)。對動物細(xì)胞培養(yǎng)來說，膜載體的生物毒性、生物相容性對細(xì)胞本身的作用是不容忽視的問題，因?yàn)檫@直接影響到細(xì)胞的生長、增殖、代謝及最終蛋白的分泌；從操作工藝角度考慮，載體材料的耐熱性也是不得不考慮的問題；另外，載體的價格及使用成本，對載體的最終使用具有決定性意義。

因此，利用有機(jī)膜材料，建立體外誘導(dǎo)hUC-MSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的有效方法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)及其應(yīng)用與使用方法。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)能夠用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，且能夠具有較高的分化率。

本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，包括膠原蛋白膜和培養(yǎng)液；

其中，培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、表皮生長因子和胰島素。

本發(fā)明將膠原蛋白作為膜載體，具有良好的生物相容性，其能夠使細(xì)胞在相對穩(wěn)定的環(huán)境中生長和分化。實(shí)驗(yàn)表明，采用膠原蛋白膜為載體誘導(dǎo) hUC-MSCs向角膜細(xì)胞分化的效率可達(dá)32％，而未采用膠原蛋白膜為載體進(jìn)行誘導(dǎo)的對比例分化效率僅為9.54％。說明采用膠原蛋白膜能夠顯著提高 hUC-MSCs向角膜細(xì)胞分化的效率。

并且，本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中添加了表皮生長因子和胰島素。其中，表皮生長因子(EGF)能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的分裂，胰島素能夠促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖、氨基酸的代謝，提高細(xì)胞的生長狀態(tài)。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加表皮生長因子和胰島素，從而提高h(yuǎn)UC-MSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的百分率。實(shí)驗(yàn)表明，添加表皮生長因子和胰島素的實(shí)驗(yàn)組hUC-MSCs向角膜上皮細(xì)胞的分化率可達(dá)32％。說明通過添加EGF和胰島素能夠顯著提高h(yuǎn)UC-MSCs向角膜細(xì)胞分化的效率。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，膠原蛋白膜中膠原蛋白的濃度為3g/L～12g/L。

在一些實(shí)施例中，膠原蛋白膜中膠原蛋白的濃度為9g/L。