[發明專利]一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201510535905.3
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN105039603A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 湯德元;王紅光;羅險峰;曾智勇;黃濤;王洪光;韋冠東;龍冬梅
• 申請（專利權）人: 貴州大學;貴州省動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

1.一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1StepBuffer25-40微升，RNaseFreeH₂O7.5-15微升，PrimeScriptOneStepEnzymeMix2-4微升，陽性對照；Part2：SolutionA200-400微升，SolutionB75-150微升，RinseA500-1000微升，RinseB800-1600微升，ElutionBuffer50-10微升，SpinColumn1-2支，CollectionTube2-3支，薄壁PCR管1-2支，上樣緩沖液1-2微升。

2.根據權利要求1所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒，其特征在于：Part1零下20℃保存，Part2室溫保存。

3.如權利要求1或2所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：包含以下步驟：

（1）取病料樣本，加入離心管中；后加入SolutionA，振蕩混勻后，室溫放置；

（2）加入SolutionB，混合均勻后，室溫放置，后離心；將上清液轉移到1#CollectionTube中，加異丙醇和冰乙酸混勻；

（3）將SpinColumn安置于2#CollectionTube上；將步驟（2）的上清液轉移至SpinColumn中，離心，棄濾液；

（4）將RinseA加入至上述SpinColumn中，室溫靜置，離心，棄濾液；

（5）將RinseB加入至SpinColumn中，離心，棄濾液；再次離心；

（6）將SpinColumn安置于離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置；離心，洗脫病毒RNA/DNA，得到病料模板；

（7）mPCR擴增：2×1StepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、上下游引物PRV、PCV2、上下游引物PRRSV、上下游引物PPV、上下游引物CSFV、上下游引物SIV、模板PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV和RNaseFreeH₂O進行PCR擴增反應；

（8）取PCR產物及陽性對照分別與上樣緩沖液混合均勻后，于1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測，紫外燈下觀察結果，即可。

4.根據權利要求3所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：首次使用前，在RinseA中添加12.5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31.5mL的100%乙醇。

5.根據權利要求3所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：設計的PRV病毒gB基因的上下游引物：

F1：5′-GACCACGCGGTCAATGTCG-3′，

R1：5′-ATGGTGGAGGTGCCCG-3′，片段192bp。

6.根據權利要求3所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：設計的PCV2病毒ORF2基因上下游引物：

F2：5′-TGGGGGATTGTATGGCGGG-3′，

R2：5′-GGCGGTGGACATGCTGAGAT-3′，片段255bp。

7.根據權利要求3所述的一種快速鑒別PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：設計的PRRSV病毒ORF6基因上下游引物：

F3：5′-TTCTGCCACCCAACACGAGG-3′，

R3：5′-GGCCGACTGCTAGGGCTTTT-3′，片段364bp。