[發明專利]用于檢測水稻條紋病毒NS2基因的qPCR引物

在審

• 申請號: 201510529152.5
• 申請日: 2015-08-26
• 公開（公告）號: CN105087830A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 鄭璐平;林辰;賀杰;吳康成;吳祖建
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及用于檢測水稻條紋病毒NS2基因表達量的qPCR引物。

背景技術

水稻在中國的分布十分遼闊，是我國重要的糧食作物，然而，水稻病毒病卻嚴重影響著中國水稻的產量和質量。水稻條紋葉枯病(Ricestripevirusdisease)是水稻病毒病之一，該病害會造成水稻減產甚至顆粒無收，被稱為水稻上的“癌癥”。

水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)是水稻條紋葉枯病的病原物，它是纖細病毒屬(Tenuivirus)的代表成員，由4條單鏈RNA組成，共編碼7個蛋白，NS2是其中的一個蛋白，但目前對該蛋白的研究較少。2011年，NS2被本課題組鑒定為弱沉默抑制子，并與水稻編碼的基因沉默抑制子3(supperssorofgenesilengcing3,SGS3)互作；2014年，本課題組又發現NS2能與水稻、煙草的纖維蛋白(Fibrillarin,Fib)互作，該互作關系影響了RSV的積累及運動。可見，NS2在RSV致病過程中起著重要的作用，對其進行深入研究，有利于完善對NS2基因功能及RSV致病機制的理解。

在研究基因功能時，往往涉及基因表達量的檢測。半定量RT-PCR法是檢測靶基因表達量的傳統方法之一，但該法只是對基因的一個非常粗略的定量，誤差較大；熒光實時定量PCR（qPCR）法是近幾十年來新興的檢測靶基因表達量的方法，該法是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法，誤差較小。在使用qPCR法時，設計合理的qPCR引物甚至、為關鍵，該發明所設計的引物尤為適合檢測水稻條紋病毒NS2靶基因的表達量。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測水稻條紋病毒NS2基因表達量的qPCR引物。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

用于檢測沉默植株中靶基因的表達量的qPCR引物，所述引物序列為NS2-qPCRF：ATCAACAGACGGAGCATC；NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT。

所述qPCR反應體系20.0μL，包括上下游引物10μM各0.4μL，SYBRqPCRMix10μL，DEPCH₂O8.4μL，cDNA0.8μL；所述qPCR反應條件為：95℃，1min；95℃，15sec；60℃，45sec，共40個循環。

本發明的優點在于：

1.引物優點：GC含量為36%-50%，擴增片段大小為107bp，在優化的體系中，引物用量合理，上述優點保證了該引物擴增片段的特異性。

2.擴增產物的溶解曲線起峰單一，為單峰圖，說明不含有非特異性擴增成分，說明產物為特異性產物，引物特異性好

3.瓊脂糖電泳圖表明擴增產物非常單一，無引物二聚體，說明引物特異性良好。

4.標準曲線顯示相關系數R²為0.995,符合R²>0.98的要求；擴增效率為0.99，介于0.90~1.05之間，符合作為qPCR引物的要求。

上述表明該引物GC含量合理，特異性強，無引物二聚體，其對應的標準曲線符合qPCR引物要求，非常適合用于檢測引物對應的靶基因表達量的檢測。

附圖說明

圖1qPCR引物擴增的基因片段M:DNA標準分子量；1：水稻條紋病毒(RSV)；2：水稻草狀矮縮病毒(RGSV)；3：水稻鋸齒葉矮縮病毒(RRSV)；4：陰性對照(滅菌水為模板)。

圖2qPCR擴增產物溶解曲線，擴增產物為NS2。橫坐標：相對熒光值；縱坐標：溫度。

圖3qPCR擴增曲線圖(A:模板為RGSVcDNA；B：模板為RRSVcDNA)橫坐標：循環數；縱坐標：熒光值。

圖4感RSV水稻病株中NS2基因表達量縱坐標:相對表達量;橫坐標:感染RSV水稻植株編號。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明作進一步說明

一、水稻病毒總RNA的提取及cDNA的轉錄

取感染水稻條紋病毒的水稻病葉0.1g，迅速放入液氮中，按北京全式金生物技術有限公司的RNA提取試劑盒(EasyPurePlantRNAKit)說明書提取RNA，具體操作如下：