[發明專利]一種利用重組枯草芽孢桿菌全細胞轉化生產L-鳥氨酸的方法

有效

• 申請號: 201510526416.1
• 申請日: 2015-08-25
• 公開（公告）號: CN105062941B
• 公開（公告）日: 2019-03-05
• 發明（設計）人: 饒志明;王梅洲;徐美娟;張顯;楊套偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/10;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

本發明公開了一種利用重組枯草芽孢桿菌全細胞轉化生產L?鳥氨酸的方法，屬于生物工程和生物技術領域。本發明將來源于Bacillus cereus的精氨酸酶成功在Bacillus subtilis 168中表達。酶活測定結果表明，重組工程菌的精氨酸酶酶活比原始菌提高了近27倍。以此工程菌作為生物催化劑，以L?精氨酸作為底物，進行轉化法生產L?鳥氨酸，采用分批補加底物L?精氨酸的方法在5?L發酵中進行轉化法生產L?鳥氨酸。12h后可以得到378.9g/L的L?鳥氨酸，底物L?精氨酸的摩爾轉化率達到99.9％。本發明方法生產L?鳥氨酸具有效率高，專一性強，能耗低等優點。

技術領域

本發明涉及一種利用重組枯草芽孢桿菌全細胞轉化生產L-鳥氨酸的方法，屬于生物工程和生物技術領域。

背景技術

L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前體物質。同時L-鳥氨酸是人體內尿素循環的重要中間代謝產物，因此其對肝臟的解毒功能具有重要的保障作用。L-鳥氨酸能夠刺激體內生長激素的分泌，促進蛋白質的合成以及糖類和脂質的分解代謝作用。L-鳥氨酸和其他氨基酸一起制成的復方氨基酸有很好的保肝護肝以及激發病態下肝臟的活力的作用。聯合使用L-鳥氨酸和苯乙酸能有效治療肝性腦病，特別是對于鳥氨酸循環障礙的患者，L-鳥氨酸能通過促進谷氨酰胺的合成和排泄來穩定的降低患者血氨濃度。鳥氨酸α-酮戊二酸鹽是很好的臨床營養劑，促進外科創傷病人的恢復，改善慢性營養不良，改善免疫功能。同時鳥氨酸和蘋果酸鹽和檸檬酸鹽合用能夠改善食品和飲料的口味，減少苦味。在歐洲、美國以及日本，L-鳥氨酸都是作為膳食藥物來銷售的。

鳥氨酸是一種堿性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有機溶劑。鳥氨酸接受二分子NH₄⁺和一分子CO₂形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鳥氨酸和尿素。

工業上L-鳥氨酸的合成包括化學合成法、微生物發酵法以及L-精氨酸水解法。微生物發酵生產L-鳥氨酸主要是通過誘變或者基因工程的方法獲得L-鳥氨酸高產菌株，以較為便宜的葡萄糖甚至是淀粉等為初始原料合成L-鳥氨酸。在這方面日本起步較早，上世紀五六十年代就開始鳥氨酸生產的研究，主要以誘變篩選為主。1957年kinoshita等首先報道了利用谷氨酸棒狀桿菌突變株發酵生產鳥氨酸。此后，Okumurahe Shibuya等人在這方面也做了大量的工作，將具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸鹽抗性的谷氨酸棒桿菌，以及具有精氨酸和鳥氨酸以及霉酚酸抗性等標記的檸檬酸節桿菌突變株用于工業生產中。國內陳寧、劉樹慶等人在1999年開始研究鳥氨酸的生產，并以谷氨酸棒桿菌為出發菌株，通過硫酸二乙酯和紫外線誘變定向選育出一種鳥氨酸生產菌，并通過發酵優化使得鳥氨酸產量達到9.85g/L。近幾年，隨著代謝工程技術的興起，通過代謝工程改造的方法，鳥氨酸的發酵生產取得一定的進展，其中，中山大學蔣玲艷等人以谷氨酸棒桿菌為出發菌株，通過表達異源的谷氨酸脫氫酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，增加代謝流中NADPH的含量，使得L-鳥氨酸產量得到提高，最終到14.8g/L，而后蔣又通過代謝進化和代謝工程的方法，最后得到鳥氨酸的產量為24.1g/L。通過發酵法進行鳥氨酸生產可以利用較簡單的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，適合于工業的發展，但發酵周期一般都相對較長，而且發酵的產量較低對于后期分離需要較高的技術需求。