[發(fā)明專利]一種基因工程菌及其在利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510522274.1
• 申請日: 2015-08-24
• 公開（公告）號: CN105177034A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;楊套偉;胡桂元;劉梅;戴悅;劉暢;李磊;周昌洋;張顯;徐美娟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所;如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P7/18;C12R1/125
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種基因工程菌及其在利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇中的應(yīng)用，屬于生物工程中基因工程和發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著能源資源的日益短缺和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，開發(fā)可再生的生物質(zhì)資源為原料，經(jīng)過化學(xué)、生物及其集成方法生產(chǎn)各種化學(xué)品、功能材料和能源物質(zhì)的生物煉制技術(shù)越來越受到國內(nèi)外的高度重視。生物柴油作為一種極具發(fā)展前景的生物資源，以其具有環(huán)保和可再生性受到世界各國的關(guān)注，該產(chǎn)業(yè)在全球范圍內(nèi)迅速發(fā)展。但其經(jīng)濟(jì)性仍然不能與傳統(tǒng)的化石能源相抗衡。其原因主要有兩方面：一方面是原料油脂價格較高；另一方面就是副產(chǎn)物甘油沒有得到很好的綜合利用。在生物柴油的生產(chǎn)過程中可得到約10％的副產(chǎn)物甘油，在原料端成本無法有效控制的前提下，如何對副產(chǎn)物粗甘油進(jìn)行深度開發(fā)，已成為生物柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和保障，同時也是無法回避的關(guān)鍵問題。如果能夠利用生物柴油副產(chǎn)物甘油開發(fā)高附加值產(chǎn)品(如1,3-丙二醇、乙二醇、2,3-丁二醇等)，就能有效地降低生物柴油生產(chǎn)成本、提高資源利用率、延伸產(chǎn)業(yè)鏈，是建立高效、經(jīng)濟(jì)的生物質(zhì)能源綜合利用產(chǎn)業(yè)的重要措施，將大大提升生物柴油產(chǎn)業(yè)的整體技術(shù)水平和循環(huán)效益。

2,3-丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航空航天等領(lǐng)域。2,3-丁二醇脫氫生成雙乙酰，是一種高價值食品風(fēng)味劑，具有一定的抑菌效果；在脫氫酶的作用下，生成的3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)是一種應(yīng)用廣泛的天然食用香料；脫水生成的甲乙酮可作為一種高價值的液體燃料添加劑，亦是重要的低沸點(diǎn)溶劑，應(yīng)用于涂料、粘結(jié)劑、潤滑劑、燃料、油墨等行業(yè)；脫水生成的1,3-丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等；酯化產(chǎn)品是合成聚酯和聚氨酯的前體。而且2,3-丁二醇是一種極具價值的液體燃料，其燃燒值與甲醇(22.1kJ/g)、乙醇(29.0kJ/g)相當(dāng)。另外，2,3-丁二醇及其衍生物亦可廣泛用于藥用載體、增塑劑、柔軟劑等的生產(chǎn)。

近年來用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇取得了較好的實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，但生物法生產(chǎn)2,3-丁二醇尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。然而從2,3-丁二醇的應(yīng)用前景、生產(chǎn)技術(shù)成熟度、知識產(chǎn)權(quán)狀況及未來發(fā)展趨勢看，開發(fā)以廉價的非糧糖質(zhì)為原料(如生物柴油副產(chǎn)物粗甘油)發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇具有很好的發(fā)展前景。目前報(bào)道的2,3-丁二醇生產(chǎn)菌株多為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)等，但這些菌大都是用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇，而在國內(nèi)利用粗甘油為原料生產(chǎn)2,3-丁二醇還未見報(bào)道；另外，這些菌種具有潛在致病性，不符合符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的要求。因此，使用安全菌種利用甘油發(fā)酵2,3-丁二醇具有良好的工業(yè)化前景。申請人前期公開了一種利用一株安全菌株BacillussubtilisCTCCM2009200發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物粗甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法(ZL201210360637.2)，為生物柴油副產(chǎn)物粗甘油進(jìn)行工業(yè)化深度開發(fā)提供了基礎(chǔ)。但是，該菌株發(fā)酵效率較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)要求，本發(fā)明基于此，對該菌株進(jìn)行基因工程改造，提高其利用甘油合成2,3-丁二醇的效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基因工程改造BacillussubtilisCTCCM2009200的方法，提高其利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的效率。

本發(fā)明所使用菌種為BacillussubtilisCTCCM2009200(已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CTCCM2009200，相關(guān)信息已在專利ZL201210360637.2中公開)。本發(fā)明首先從BacillussubtilisCTCCM2009200中克隆出參與2,3-丁二醇合成途徑中輔酶循環(huán)再生的關(guān)鍵酶基因甘油脫氫酶(gdh)和乙偶姻還原酶(acr)以及調(diào)控2,3-丁二醇支路關(guān)鍵酶酶活的調(diào)控因子aslR，并將該基因與穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-HpaII連接，成功構(gòu)建了攜帶基因gdh,acr和aslR基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，并轉(zhuǎn)入BacillussubtilisCTCCM2009200中，獲得加強(qiáng)gdh,acr和alsR基因表達(dá)的重組枯草芽孢桿菌(命名為GAR)。并對原始菌及重組菌GAR利用甘油合成2,3-丁二醇發(fā)酵性能檢測，說明加強(qiáng)gdh,acr和alsR基因的表達(dá)能夠提高2,3-丁二醇產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物如3-羥基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的積累。