[發(fā)明專利]一種監(jiān)測畢赤酵母發(fā)酵終點的方法

在審

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• 申請日: 2015-08-21
• 公開（公告）號: CN105112496A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 張穎;孔凡樓;孫健;楊雨;孫劍鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南康和醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G01N27/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及畢赤酵母表達外源蛋白領(lǐng)域，特別涉及在使用畢赤酵母誘導表達外源蛋白工藝中監(jiān)測發(fā)酵終點的方法。

背景技術(shù)

畢赤酵母是多種蛋白的理想表達體系(CereghinoGP,CereghinoJL,IlgenC,CreggJM.ProductionofrecombinantproteinsinfermenterculturesoftheyeastPichiapastoris.CurrOpinBiotechnol.2002,13(4):329–332)，其在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)時，一般分為三個階段(Invitrogenlifetechnologies公司，Pichiafermentationprocessguidelines)：首先利用基礎(chǔ)鹽溶液、PTM1微量元素作為初始培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵培養(yǎng)；然后待分批發(fā)酵培養(yǎng)至甘油完全耗盡時，進行甘油分批補料培養(yǎng)；最后待甘油分批補料培養(yǎng)結(jié)束后，進行甲醇分批補料培養(yǎng)，即蛋白生產(chǎn)階段。其中，在蛋白生產(chǎn)階段的后期，菌體死亡時釋放出的蛋白水解酶會降解蛋白，導致發(fā)酵產(chǎn)量降低，因此，選擇合適的方法判斷發(fā)酵終點及時結(jié)束發(fā)酵對獲得高蛋白產(chǎn)量至關(guān)重要。

目前，判斷發(fā)酵終點一般采用高效液相色譜法或經(jīng)驗法。高效液相色譜法能夠準確地檢測發(fā)酵液中目的蛋白的含量來判斷發(fā)酵終點(CN104297378A)，然而，此方法需要專門的儀器，購買及運行成本較高，并且設備準備時間和檢測時間較長，待檢測出結(jié)果后，往往錯過了最合適的放罐時間，導致部分產(chǎn)品被降解，延長生產(chǎn)周期，這樣不僅無法獲得高產(chǎn)量，還增加了雜質(zhì)含量以及后續(xù)的純化工藝成本。經(jīng)驗法是生產(chǎn)中常用的發(fā)酵終點判斷方法，在特定工藝條件、多批生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，發(fā)酵培養(yǎng)至一定時間后即結(jié)束發(fā)酵(CN101348820B)，而對于畢赤酵母發(fā)酵，通常當菌濃增加緩慢時結(jié)束發(fā)酵(劉海峰。重組胰島素前體轉(zhuǎn)化成人胰島素和地特胰島素的工藝研究。華東理工大學博士學位論文。2013)，但這種經(jīng)驗法無法準確判斷發(fā)酵終點，常常導致提前或者延后結(jié)束發(fā)酵，給生產(chǎn)造成損失。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種監(jiān)測畢赤酵母發(fā)酵終點的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)無法快速、準確判斷畢赤酵母發(fā)酵終點以及降低純化成本的問題。

本發(fā)明是通過測定發(fā)酵液的菌濃和電導率指標聯(lián)合判斷畢赤酵母的發(fā)酵終點，具體步驟為：

(1)發(fā)酵液的定時取樣：誘導表達開始后定期連續(xù)取發(fā)酵液樣品；一般在發(fā)酵過程中當誘導表達開始后每12小時取發(fā)酵液樣品一次，待誘導表達36-48h后增大取樣頻率，每1-6h取樣一次。

(2)發(fā)酵液樣品的處理：根據(jù)所測定指標的不同對樣品進行離心或稀釋處理；

(3)測定指標：處理完的樣品測定菌濃以及電導率，并繪制菌濃和電導率隨誘導時間的變化曲線圖；

(4)發(fā)酵終點的判斷：監(jiān)測發(fā)酵液菌濃和電導率隨發(fā)酵時間的變化，當菌濃指標達到最高點、電導率降低至28～35mS/cm時為發(fā)酵終點。

上述方法中測定的菌濃指標為菌體濕重、菌體干重、OD₆₀₀中的一種，當測定菌體濕重時需要取發(fā)酵液樣品1～5ml置于預先稱重的離心管中于3000～12000rpm離心5～10分鐘并棄去上清進行樣品的前處理準備；當測定菌濃中菌體干重時樣品處理方法為：取發(fā)酵液樣品1～5ml置于預先稱重的離心管中于3000～12000rpm離心5～10分鐘，棄去上清，并置于80℃真空干燥至恒重；測定菌濃中OD₆₀₀的樣品的處理方法為：將發(fā)酵液樣品用水稀釋100～1000倍，使最終讀數(shù)在0.2～0.8之間；

測定電導率時樣品的處理方法為：取發(fā)酵液樣品1～5ml于離心管中，3000～12000rpm離心5～10分鐘。

優(yōu)選的步驟(3)中電導率的測定中取離心后的樣品用純水稀釋5～10倍后檢測電導率。

監(jiān)測發(fā)酵液菌濃和電導率隨誘導時間的變化，當菌濃增加緩慢接近最高點或達到最高點后開始下降，同時電導率降低至28～35mS/cm，即為發(fā)酵終點。

優(yōu)選的，當菌濃增加緩慢接近最高點或達到最高點后開始下降，同時電導率降低至30～32mS/cm，即為發(fā)酵終點。

本申請中的畢赤酵母發(fā)酵為在發(fā)酵罐中利用畢赤酵母進行甲醇誘導表達外源蛋白的過程。畢赤酵母發(fā)酵過程中的蛋白生產(chǎn)階段，菌體一邊利用甲醇產(chǎn)生目的蛋白，一邊緩慢生長導致菌濃增加，而在畢赤酵母發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的鹽除了維持菌體內(nèi)外滲透壓平衡，還要滿足菌體生長、代謝的需要，所以鹽濃度隨著發(fā)酵的進行而降低，宏觀表現(xiàn)為電導率的降低。