[發(fā)明專利]一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2015-08-14
• 公開（公告）號: CN105039364A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廉國勝;柯明劍;林加燕;汪海波;田綠波;莫秋華;楊澤;馮子力;蘇影;李艷蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海國際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 張奇洲;華輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列。

背景技術(shù)

西表伊蚊，Aedes(Verrallina)iriomotensis(TanakaandMizusawa，1973)，屬雙翅目(Diptera)、蚊科(Culicidae)、伊蚊屬(Aedes)、奇陽蚊亞屬(Verrallina)。伊蚊是蚊科中最大一屬，近1000種，中國有100余種。伊蚊會傳播很多疾病，對人類的健康帶來了危害，黃熱病與登革熱就主要通過伊蚊傳播。中國伊蚊中研究比較多的是埃及伊蚊和白紋伊蚊。但目前對西表伊蚊的研究比較少，是否可能攜帶病毒及傳播疾病還知之甚少，有待進(jìn)一步研究。

對蚊蟲的鑒定和識別，是監(jiān)測和控制蚊媒傳染病的基礎(chǔ)，也是疾病預(yù)防與控制的重要步驟。目前對蚊蟲的鑒定主要依靠經(jīng)驗豐富的分類學(xué)家對蚊蟲的形態(tài)特征，但對近緣種或形態(tài)殘缺標(biāo)本的鑒定十分困難。急需新的方法，以彌補傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的缺陷。

DNA條形碼技術(shù)(DNABarcoding)是通過對一個標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個行之有效的生物鑒定手段，不僅可對傳統(tǒng)鑒定方法作強有力的補充，而且因為其更客觀、準(zhǔn)確，突破以往對經(jīng)驗的過度依賴，能幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關(guān)系等。

作為DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)目的基因，一方面必須足夠保守，便于利用通用引物進(jìn)行大范圍的擴增；另一方面，要有足夠的變異來區(qū)分不同的物種。因此，鑒定不同的物種類群需要選擇有效的目的基因。目前，在系統(tǒng)發(fā)育研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)志基因是核糖體12S和16S基因，但因其存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，不宜用作條形碼基因。線粒體基因組中存在的13個蛋白編碼基因中僅細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(CytochromeOxidaseSubunitⅠ,COⅠ)、線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)、ND4、ND5這4個基因滿足基因插入和缺失現(xiàn)象較少、長度在900bp左右這兩個條件，但ND4、ND5進(jìn)化太快，不可能設(shè)計出通用引物，限制了它們作為全面DNA鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。因此，人們最終選定COⅠ基因中的一個片段作為DNA條形碼基因。迄今為止，已有諸多研究證明COⅠ基因在鳥類、魚類、鱗翅目昆蟲、蚊類、蟻類和彈尾目等類群的分類鑒定中行之有效。因此，可以采用基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)對蚊類進(jìn)行分子鑒定。該方法與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全等問題，而且有利于實現(xiàn)蚊類的快速鑒定。目前，該方法在蚊類分子鑒定中的應(yīng)用僅局限在少數(shù)蚊種，Genbank中也僅有少數(shù)蚊種的COⅠ基因序列，但至今尚無西表伊蚊的相關(guān)基因序列。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明公開了一種西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列及其檢測和鑒定方法。

一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，所述基因為西表伊蚊COⅠ基因，其如序列表SEQIDNO.1所示：

本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列在檢測和鑒定西表伊蚊中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用包括西表伊蚊的分子鑒定方法，包括以下步驟：

1)從待測的組織中分離提取DNA；

2)以該DNA為模板，選擇相應(yīng)PCR引物,通過PCR擴增待測組織的COⅠ基因；

3)然后取適量步驟2)擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)染色后觀察，如果能特異性擴增出,600bp左右的條帶，則對其進(jìn)行測序；

4)將測序結(jié)果與序列表SEQIDNO.1所示的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列相比較，如二者同源性在98％以上，即可判斷所述的待測組織即為西表伊蚊。

本發(fā)明提供的西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列有利于實現(xiàn)西表伊蚊的快速鑒定，縮短鑒定時間。本發(fā)明的鑒定方法填補了西表伊蚊分子鑒定領(lǐng)域的空白，相對傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定更高效便利，減少誤差，保證結(jié)果具有可靠性。

為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。

附圖說明

圖1為西表伊文COⅠ基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，1號-11號：西表伊蚊；M：MarkerDL100bp；12號：空白對照。

圖2和圖3為待檢測組織PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，圖2：1號-6號：待檢測組織，M：MarkerDL100bp；圖3：1號：空白對照，2號-6號：待檢測組織，M：MarkerDL100bp。

具體實施方式