[發明專利]一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅動的Fat-1表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201510502021.8
• 申請日: 2015-08-14
• 公開（公告）號: CN105274139A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 樊懿萱;王鋒;鐘部帥
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種山羊骨骼肌特異性基因actin啟動子驅動的Fat-1表達載體，其特征在于該表達載體是首先將Fat-1基因克隆入pEGFP-N1載體，構建成pEGFPN1-Fat-1載體，然后將PCR擴增得到的CMV增強子插入無啟動子和增強子的pEGFPN1-Fat-1載體，構建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體，最后將骨骼肌特異性基因α-actin啟動子插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體中，構建成的α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表達載體。

2.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于該表達載體的具體構建過程為：

(1)利用平末端連接構建pEGFPN1-Fat-1載體：

將PCAGGS-Fat-1質粒經EcoRI酶切后回收Fat-1基因，將pEGFP-N1質粒經BamHI酶切后回收線性化的pEGFP-N1質粒載體，將回收后的Fat-1基因和線性化的pEGFP-N1質粒載體的cDNA末端補平，進行平末端連接構建成pEGFPN1-Fat-1載體；

(2)構建pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體：

根據PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設計一對含有特異性酶切位點的引物，通過PCR方法擴增CMV-Enhancer基因，然后與19-TVector連接得到19-T-CMV-enhancer載體，利用SalI和AseI雙酶切19-T-CMV-enhancer載體并回收酶切產物CMV-Enhancer基因片段，將酶切產物定向克隆到無啟動子和增強子的pEGFPN1-Fat-1載體質粒中，構建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體；

所述的含有特異性酶切位點的引物為：

Enhancer-F：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC

Enhancer-R：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG

(3)構建α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表達載體：

采用分段PCR擴增的方法，分別從羊肌肉組織DNA中擴增1824bp和1347bp兩片段Part1和Part2，同時首尾相連插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer質粒同一位置構建成α-actinpromoter-pEGFPN1-Fat-1表達載體；各片段引物為：

part1F:TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCCCTCACTATTCTTTT

part1R:CTGGGCAGCAGTTTTCCT

part2F:GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCAACGTCCTTGTCTT

part2R:CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCTTCTCTCGGCGCTGTCCGCT。

3.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于步驟(3)中擴增Part2時，添加DMSO進行擴增優化。

4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于擴增Part2時，20μL體系中添加0.6～0.8μLDMSO進行擴增。