[發明專利]檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201510498434.3
• 申請日: 2015-08-13
• 公開（公告）號: CN105177180B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 劉麗娟;陳倩;王福祥;劉瑋;楊宇;王靜;徐寶梁
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院;王福祥;劉瑋
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 劉徐紅

本發明涉及一種檢測腹地病毒的實時熒光定量RT?PCR試劑盒和方法，屬于生物技術領域。該試劑盒包括：2×RT?PCR反應液、25×RT?PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探針、陰性對照和陽性對照；上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示；探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示，探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；陰性對照為無核酸酶滅菌超純水；陽性對照為包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。該實時熒光定量PCR檢測試劑盒使用方便，試劑盒所用的試劑少，大大簡化了操作過程，減少了在操作過程的污染，檢測特異性強，靈敏度高，適用于快速檢測腹地病毒。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR(逆轉錄PCR)檢測試劑盒和方法。

背景技術

腹地病毒(Hearstlands Virus)屬于布尼亞病毒科腹地病毒組成員，最近被分到白蛉病毒屬中。該病毒于2012年在兩名密蘇里州的公民因為發燒和頭痛而住院就診時，這種傳染病才被第一次記述。人和家畜可被攜帶有該病毒的蜱蟲叮咬而感染，出現中樞神經系統癥狀，不但造成人類疾病和死亡，更會造成家畜死亡，導致經濟損失，引起公共衛生問題。

目前，腹地病毒檢測的金標準是病毒分離，但因其操作繁瑣、技術難度大、耗時長、實驗條件要求高、在實際工作中難以推廣應用。近年來應用廣泛的常規核酸擴增及實時熒光定量PCR在病毒的檢測方面發揮了重要作用。但是，鑒于蜱蟲樣本中病原載量較低等原因，建立一種快速、靈敏的檢測技術，更利于蜱中載量較低的病毒檢測。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一組用于檢測腹地病毒的引物對和核酸序列；本發明還提供一種用于檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR試劑盒及其檢測方法。本發明利用TaqMan探針實時熒光PCR技術，建立一種快速、敏感的檢測方法，應用于腹地病毒的監測檢測。

本發明采用以下技術方案：

一種檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR引物對，所述引物對的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。

一組檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR核酸，該組核酸包括引物對、探針和作為陽性對照的擴增產物，所述引物對的核苷酸序列如序列表中序列1和序列表中序列2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述作為陽性對照的擴增產物包含有如序列表中序列4所示的核苷酸序列。

一種檢測腹地病毒的實時熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒主要包括該試劑盒包括：2×RT-PCR反應液、25×RT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探針、陰性對照和陽性對照；具體組成如下：

2×RT-PCR反應液(2×RT-PCR buffer)；

25×RT-PCR酶混合液(25×RT-PCR Enzyme Mix)；

上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；

下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；

探針：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；

陰性對照：無核酸酶滅菌超純水；

陽性對照：包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。

如上所述的試劑盒，優選地，所述熒光基團為FAM、CY3中任意一種，所述淬滅基團為BHQ1、TAMARA和BHQ2中任意一種。

一種利用TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法檢測腹地病毒的非診斷性方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取病毒RNA；