[發明專利]兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510496627.5
• 申請日: 2015-08-13
• 公開（公告）號: CN105085676A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 卜登攀;孫鵬;王加啟;王建;南雪梅;杜洪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K1/34;C07K1/22;G01N33/68
• 代理公司: 北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍;李霞

1.一種兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將乳鐵蛋白與免疫佐劑混合，得到含有復合佐劑的乳鐵蛋白溶液；

(2)用含有復合佐劑的乳鐵蛋白溶液免疫新西蘭白兔，獲取抗血清；離心，取上清，得到抗血清；

(3)將抗血清依次用免疫磁珠法和蛋白A親和層析法進行純化，得到純化的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體。

2.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于：將乳鐵蛋白與CpG佐劑溶于PBS中得到混合溶液，再與Al(OH)₃混合，得到含有復合佐劑的乳鐵蛋白溶液；優選的，將0.5mg乳鐵蛋白與50μgCpG佐劑溶于1mLPBS中得到混合溶液；將混合溶液與Al(OH)₃按照1:5的體積比混合，得到含有復合佐劑的乳鐵蛋白溶液。

3.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的免疫方式包括：采用皮下多點注射法的方式將含有復合佐劑的乳鐵蛋白溶液免疫新西蘭白兔，免疫的次數為4次。

4.按照權利要求3所述的制備方法，其特征在于：其中，第1次免疫的4周后，進行第2次免疫；以后每2周重復免疫1次，進行第3次和第4次免疫；第4次免疫后的第7天收集抗血清；優選的，第1次免疫時，每只兔免疫500μg乳鐵蛋白；第2次、第3次和第4次免疫時，每只兔每次免疫250μg乳鐵蛋白。

5.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述免疫磁珠法純化抗血清包括：將磁珠加入到離心管中，在磁力分離器上放置，吸去上清液，加入稀釋的抗血清，靜置，吸去上清液；重懸磁珠，重復清洗，吸去上清液；加入枸櫞酸鈉緩沖液，渦旋震蕩，靜置，吸取上清液，重復清洗，將所得上清液混合，得到純化后抗體；

優選的，取100μL磁珠加入2mL離心管中，在磁力分離器上放置3min后吸去上清液，加入300μL按照1:100的比例稀釋的抗血清，4℃條件下保持傾斜緩慢旋轉10min，而后靜置3min后吸去上清液，用pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸磁珠，重復清洗3遍后，離心管再次在磁力分離器上放置3min吸去上清液，加入pH3.0的0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液，渦旋震蕩3min，然后再在磁力分離器上放置2min后吸取上清液，重復清洗3遍，將所得上清液混合，得到純化后抗體。

6.按照權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將抗血清用蛋白A親和層析法進行純化的方式包括：

上樣前首先用結合/洗滌緩沖液平衡蛋白A-瓊脂糖-4B并裝柱，洗去所含蛋白質等雜質，待流出洗脫液OD₂₈₀<0.02時；將結合/洗滌緩沖液稀釋后的抗血清加入柱中，待全部血清樣品進入柱床后，用結合/洗滌緩沖液沖洗柱子，待洗脫液OD₂₈₀<0.02時，用pH＝2.8的3.5％冰乙酸洗脫，將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的容器中，濃縮，即得；

優選的，所述的結合/洗滌緩沖液為含有1MNaCl的0.1mol/LTris-HCl緩沖液，其pH＝8.6；

上樣前首先用結合/洗滌緩沖液平衡蛋白A-瓊脂糖-4B并裝柱，以1mL/min流速洗去雜質；待流出洗脫液OD₂₈₀<0.02時，將結合/洗滌緩沖液稀釋后的血清樣本(1:4，v/v)加入柱中，待全部血清樣品進入柱床后，用結合/洗滌緩沖液沖洗柱子并使緩沖液流出速度約1mL/min，待洗脫液OD₂₈₀<0.02時，用pH＝2.8的3.5％冰乙酸洗脫，將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的容器中以中和洗脫液pH至7.3；

所述的濃縮是用10kDa超濾管進行濃縮。

7.由權利要求1-6任何一項制備方法得到的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體。

8.權利要求7所述的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體在定性或定量檢測乳、乳制品或乳腺中乳鐵蛋白中的應用。

9.一種定性或定量檢測乳鐵蛋白的ELISA試劑盒，包括：檢測抗體、抗體稀釋液、包被緩沖液、封閉液、PBS緩沖液、洗滌緩沖液、終止液；其特征在于：所述的檢測抗體是權利要求7所述的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體。

10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于：

所述包被緩沖液是：溶劑為超純水，溶質為Na₂CO₃和NaHCO₃，所述溶質Na₂CO₃和NaHCO₃在包被緩沖液中的濃度為0.05M，pH為9.6；

所述封閉液是：溶劑為超純水，溶質為卵清白蛋白，所述溶質卵清白蛋白在封閉緩沖液中的濃度為1％；

所述PBS緩沖液是：溶劑為超純水，溶質為NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄，所述溶質NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS緩沖液中的濃度分別為8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值為7.4；

所述洗滌緩沖液是：溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫-20，所述溶質吐溫-20在所述洗滌緩沖液中的濃度為50mL/L；

所述抗體稀釋液是：溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫-20和明膠，所述溶質吐溫-20和明膠在所述抗體稀釋液中的濃度分別為10mL/L和0.01M；

所述終止液是：2M的硫酸水溶液；

所述底物溶液A：溶劑為超純水，溶質為過氧化氫脲、Na₂HPO₄、檸檬酸和吐溫-20，所述過氧化氫脲、Na₂HPO₄、檸檬酸和吐溫-20在所述底物溶液A中濃度分別為1g/L、14.2g/L、9.42g/L和0.1mL/L；

所述底物溶液B：溶劑為超純水，溶質為四甲基聯苯胺、檸檬酸和硫代硫酸鈉，四甲基聯苯胺、檸檬酸和硫代硫酸鈉在所述底物溶液B中的濃度分別為0.4g/L、1.83g/L和0.1g/L。