[發明專利]一種食用真菌的單孢雜交方法

在審

• 申請號: 201510494440.1
• 申請日: 2015-08-12
• 公開（公告）號: CN105039304A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 譚偉;周潔;曹雪蓮;苗人云;王國英;楊俊輝;唐杰;賈定洪;吳翔;謝麗源;甘炳成;黃忠乾;彭衛紅;王勇;姜鄰;唐利民;王波
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院土壤肥料研究所
• 主分類號: C12N15/04
• 分類號: C12N15/04
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及一種食用真菌的育種交配方法，具體涉及一種食用真菌的單孢雜交方法。

背景技術

食用真菌育種研究中的交配方法主要是單孢雜交，也稱單、單交配。當前，育種者實際雜交操作的是親本單孢子萌發形成的單核菌絲之間的雜交，而且單孢雜交都是在固體培養基質上進行，同時在固體培養基上配對雜交，需要仔細移植對位種塊、挑取交接區域菌絲、培養菌絲插片、取插片菌絲鏡檢確認具有鎖狀聯合的雙核菌絲等操作環節，存在著步驟繁瑣、而且交配時間長、效率不高等缺點。

例如，現有技術劉都才、楊曙湘(1989)的配對雜交方法是將兩個不同親株的單核菌絲體同時接種在平板培養基上，相距0.5～1.0厘米，培養7～10天，待兩菌絲體接觸后，挑取接觸部分的菌絲鏡檢，如發現鎖狀聯合，立即將此接觸部分的菌絲體轉移到新鮮斜面培養基上培養。該方法是在PDA固體培養基上進行交配，需要仔細移植配位種塊，操作復雜繁瑣，花費較多工作精力和工作時間。

謝芝芳(2005)的單核體配對雜交方法是將兩親本單核體菌株在加富PDA斜面培養基上兩兩配對雜交，接種塊兩兩間相距約2cm，待兩菌落接觸后，挑取接觸處菌絲體轉管繁殖備用。配對組合有：西德33×閔31；西德33×曲師9111；西德33×P235；西德33×川白1號；西德33×側5；西德33×雜優1號。該方法同樣是在PDA固體培養基上進行交配，其缺點仍然是需要仔細移植配位種塊，操作顯得繁瑣，花費較多工作精力和工作時間。

邊銀丙、常堃、蔡婧(2014)的多孢自交方法是利用液體培養基多孢自交的育種選育金針菇新菌種，包括以下步驟：(1)從親本菌株高郵738的子實體中收集單孢子制成孢子液；(2)將含親本菌株的孢子液加入液體培養基中搖菌，進行多孢自交；(3)將液體菌種搖瓶培養并進行搔菌處理；(4)通過栽培和篩選獲得目標菌株金針。該方法是采用多孢懸浮液在常規三角瓶中進行育種，接觸不充分，成功率不高。

邱立友、王蘭青、王淑敏等人(2007)的一種食用菌液體菌種的固化處理方法，包括以下步驟：(1)試管保藏母種擴管活化：將保藏的母種轉接到試管斜面上，在適溫下培養；(2)制作搖瓶液體菌種；(3)發酵罐深層培養；(4)載體物質處理；(5)液體菌種固化。該方法中液體菌種在三角瓶中培養，其缺點是三角瓶在搖瓶時占的位置太大，效率不高；三角瓶的空間太大，菌種塊的生長速度慢。

王瑞娟、尚曉冬、張美彥、周峰(2013)一種食用菌交配型研究中檢測鎖狀聯合的方法包括：制備專用培養基；將培養基滅菌，用分液器分裝至一次性平板中，將測試單核菌株緊挨兩兩接種于平板中央，置于25～26℃培養室中培養，7～8天后觀測菌絲生長區域是否有鎖狀聯合。該方法同樣是在PDA固體培養基上進行交配，其缺點仍然是需要確定可信區域然后挑取菌絲進行鏡檢觀察，這樣使得挑取的部位準確性不高，不可避免人為誤差和工作量大。

綜上，尋求一種操作簡單、時間縮短、省工省力、準確性高的食用真菌的單孢雜交方法，可有效地提高了育種研究工作效率，目前尚未見有食用真菌單孢雜交在液體專用培養基質中進行交配的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種操作簡單、時間縮短、省工省力、準確性高的食用真菌的單孢雜交方法。

本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一種食用真菌的單孢雜交方法，包括以下步驟：

(1)親本單核菌絲體的預備：分別從食用真菌親本的子實體中收集孢子，用無菌水制成孢子為0.5～1.5×10^-6的懸浮液，均勻涂布于PDA培養基上，23～25℃下培養3～4天，挑取連帶基質的星芒狀細小菌落移植到PDA培養基上再培養，再挑取其菌絲于顯微鏡下檢查無鎖狀聯合，而且出菇試驗驗證不出菇，即獲得了其單核菌絲，培養單核菌絲菌落至7mm以上，備用；

(2)YMG液體專用培養基的制備、分裝及滅菌：分別稱取酵母膏3.8～4g、麥芽浸膏4.8～5g、葡萄糖18～20g、磷酸二氫鉀0.8～1g、硫酸鎂0.3～0.5g，混合添加于自來水中，適當加熱使其溶解，最后用水定容至1000ml，得到YMG液體專用培養基；然后分裝至2.6cm×20.2cm玻璃試管中，裝液量25～30ml/支，滅菌，冷卻；

(3)液體培養下配對交配：在無菌操作下，采用打孔器(打孔直徑7mm)打取供親本菌株的兩單核菌絲菌種塊，兩接種塊緊密挨著接入試管培養基中，置放于搖床內，在23～25℃、轉速100～200r/min條件下振蕩培養4～5d，可見，因振蕩作用兩個菌種塊緊密攪渾“成團”在一起，雙親單核菌絲充分接觸并交配；