[發明專利]一種ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應用

在審

• 申請號: 201510494114.0
• 申請日: 2015-08-12
• 公開（公告）號: CN105087516A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 王章英;房伯平;陳新亮;陳景益;張雄堅;黃立飛;羅忠霞
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 張耐寒

本發明提供一種ADP?葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應用，該篩選方法包括以下步驟：1)第一鏈cDNA的合成；2)PCR擴增；3)構建AGPase大小亞基cDNA原核表達載體；4)活性篩選。本發明將來源于不同物種的AGPase大亞基基因與小亞基基因進行遠緣雜交，高可控性地獲重組基因的表達載體；再轉化大腸桿菌glgC突變菌株，再接種于Conberg加富固體培養基上，最后用碘?碘化鉀染色篩選出高活性ADP?葡萄糖焦磷酸化酶突變體，該篩選方法簡單易行、穩定可靠；該ADP?葡萄糖焦磷酸化酶突變體酶活性、糖原含量明顯高于野生型玉米AGPase，且對底物親和力沒有明顯改變，但對激活劑敏感性增加。

技術領域

本發明涉及一種ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其篩選方法與應用。

背景技術

淀粉在人類生活中占有重要地位。據統計，全世界80％以上的淀粉來自于玉米，其中美國的這一比例更高達95％以上。其中ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucosepyrophosphorylase，簡寫為AGPase)是植物淀粉合成過程中的關鍵酶，催化1-P-Glucose和ATP生成的ADPG作為淀粉合成酶的底物參與淀粉的合成。它的活性是決定淀粉積累速率的關鍵因素。編碼擬南芥葉片的AGPase的一個亞基的基因突變可將該酶活性降低到7％，淀粉積累減少到26％(Lin T P,Caspar T,Somenrllle C.Starch deficient mutantArabidopsis with low ADP-glucose pyrophosphorylase activity lacks one of thesubunits of the enzyme.Plant Physiol.1988,88:1175-1181)。玉米胚乳shrunken-2和brittle-2突變體(分別為AGPase大小亞基基因的缺失突變體)僅含5-10％的酶活性，淀粉含量僅是野生型玉米的25-30％(M R.Lawrence,S Barton.Identification and molecμLar characterization of shrunken-2 cDNA clones of maize.Plant Ce11.1990,2:581-588；Tsal C Y,Nelson O E.Starch-deficient maize mutant lacking ADP-glucosepyrophosphorylase activity.Science,1966,151:341-343)