[發(fā)明專(zhuān)利]穗花杉雙黃酮在制備骨組織工程種子細(xì)胞中的試驗(yàn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510475586.1
• 申請(qǐng)日: 2015-08-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105176921B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐道華;周晨慧;張雪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 廣州恒華智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44299
• 代理人: 姜宗華

1.穗花杉雙黃酮促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖及其成骨分化的用途，其特征在于，所述用途通過(guò)以下試驗(yàn)步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)MSCs細(xì)胞培養(yǎng)

將MSCs置于含8～12％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3d換液1次，細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，0.25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)；

(2)細(xì)胞增殖檢測(cè)

MSCs細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞增殖檢測(cè)采用MTT法；空白組和濃度分別為0.1、1、5、10、50μmol·L^-1穗花杉雙黃酮組分別處理后，加入MTT使其終濃度為0.45～0.55mg/mL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～5h，棄培養(yǎng)液，加入140～160μL DMSO使甲瓚顆粒完全溶解，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570nm測(cè)定吸光度值，結(jié)果表明5μmol·L^-1-50μmol·L^-1穗花杉雙黃酮可促進(jìn)MSCs增殖；

(3)堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定

細(xì)胞完全融合后，每孔分別加入含0、0.1、1、5、10μmol·L^-1濃度穗花杉雙黃酮的成骨誘導(dǎo)液，所述成骨誘導(dǎo)液由內(nèi)含0.01mmol·L^-1地塞米松、50μmol·L^-1維生素C和10mmol·L^-1β-磷酸甘油α-MEM完全培養(yǎng)基組成；隔天換液，6～8d后吸出各孔培養(yǎng)液，各孔加入45～55μL細(xì)胞裂解液，采用試劑盒檢測(cè)堿性磷酸酶活性，Bio-Rad法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果顯示0.1、1、5、10μmol·L^-1濃度穗花杉雙黃酮濃度依賴(lài)性地增強(qiáng)MSCs成骨分化中的ALP活性；

(4)堿性磷酸酶染色

PBS洗滌細(xì)胞表面兩次，小心吸去PBS；每孔加入70％乙醇固定細(xì)胞8～12min，小心吸去乙醇，加入堿性磷酸酶緩沖液480～520μl平衡5min，重復(fù)兩次；小心吸去堿性磷酸酶緩沖液，每孔加入280～320μLNBT/BCIP染色液，37℃下暗室里孵育25～35min；小心吸去染色液；加入0.8～1.2ml蒸餾水終止反應(yīng)；顯微鏡下觀察，拍照；

(5)骨鈣素測(cè)定

細(xì)胞完全融合后，每孔分別加入含0、1、5、10μmol·L^-1濃度穗花杉雙黃酮的成骨誘導(dǎo)液，每3天更換一次培養(yǎng)液，12天后收集上清液，采用骨鈣素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行骨鈣素水平測(cè)定，結(jié)果顯示1、5、10μmol·L^-1濃度穗花杉雙黃酮提高了MSCs成骨分化中骨鈣素分泌。