[發(fā)明專利]一種制備葡萄潰瘍病菌分生孢子的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510475573.4
• 申請(qǐng)日: 2015-08-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104974975B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉梅;李興紅;燕繼曄;張瑋;周瑩;陳震
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N3/00
• 分類號(hào): C12N3/00
• 代理公司: 北京惟誠(chéng)致遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳

1.一種制備葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodia theobromae分生孢子的方法，包括以下步驟：

1)將葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodia theobromae接種到PDA培養(yǎng)基上，在每天11-13小時(shí)光照的條件下，于25-28℃培養(yǎng)箱中，用9cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)菌株至菌落生長(zhǎng)直徑為7-8cm；其中，PDA培養(yǎng)基的制備方法為將洗凈去皮的馬鈴薯200g，加水1L煮沸半小時(shí)，用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)铀a(bǔ)足至1L，加入20g葡萄糖和20g瓊脂粉，加熱至瓊脂粉溶化，倒入300mL三角瓶中分裝，高壓濕熱滅菌，121℃，20min；

2)選取對(duì)葡萄潰瘍病菌敏感的葡萄品種作為接種材料，將健康的葡萄綠枝條剪成28-32cm，先表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗，于滅菌的濾紙上晾干；用滅菌的打孔器在綠枝條上打孔，去掉韌皮部；其中，所述對(duì)葡萄潰瘍病菌敏感的葡萄品種為夏黑品種葡萄；

3)將步驟1)培養(yǎng)獲得的菌落用滅菌的打孔器制備菌絲塊，將制備好的菌絲塊接種于打孔處，用封口膜包裹菌絲塊保濕，并將接種過(guò)的枝條插入裝有無(wú)菌水的組培瓶?jī)?nèi)，于28-30℃、每天11-13小時(shí)光照的條件下培養(yǎng)；其中，在相對(duì)濕度大于90％的條件下培養(yǎng)36-48小時(shí)，然后濕度維持在70-80％，培養(yǎng)5-10天；培養(yǎng)5-7天時(shí)，枝條上布滿黑色的小點(diǎn)狀的分生孢子器，內(nèi)部有大量分生孢子；

步驟2)中，所述打孔器的打孔直徑為5-8mm，打孔的位置選取枝條的中部；所述表面消毒是用次氯酸鈉消毒，所述次氯酸鈉的質(zhì)量百分濃含量為1％-3％，消毒的時(shí)間是1-3分鐘；

步驟3)中，所述打孔器的打孔直徑為5-8mm；打孔位置沿著菌落邊緣；

所述方法中還包括將獲得的分生孢子制備孢子懸浮液的方法：用剪刀將步驟3)中布滿小黑點(diǎn)的葡萄枝條剪成0.5cm大小，放入裝有1.5ml無(wú)菌水的離心管中，采用研磨槍組織研磨1-2min，在振蕩器上震蕩1min，使分生孢子器破裂釋放出孢子，然后采用2層脫脂紗布過(guò)濾除去枝條殘?bào)w和菌絲，濾液即為葡萄潰瘍病菌的孢子懸浮液。