[發明專利]利用SOD酶鑒定紫花苜蓿耐熱性的方法

在審

• 申請號: 201510470621.0
• 申請日: 2015-08-05
• 公開（公告）號: CN105154518A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 趙雁;畢玉芬;車偉光;何永宏
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域：

本發明涉及利用SOD酶鑒定紫花苜蓿耐熱性的方法，屬于植物耐熱性鑒定技術領域。

背景技術：

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為苜蓿屬(MedicagoL.)植物，是最重要的豆科牧草，世界范圍內廣泛栽培，在傳統的種植業結構和畜牧業生產中有著其它牧草無可替代的作用。紫花苜蓿的最適生長氣溫為15℃～21℃，最適生長土壤溫度為12℃。白天紫花苜蓿可忍受30℃～35℃的高溫，但再生過程對高溫極為敏感。在夏季最高溫度超過30℃的地區，紫花苜蓿越夏困難，田間時有植株死亡，并且高溫后恢復的過程越緩慢。然而在實際生產中，我國南方地區部分田間氣溫常常高于40℃，高溫伴隨著干旱和各種病害的發生，高溫導致紫花苜蓿生長勢減弱、抗性下降，從而導致產量降低和品質下降。

耐熱性差的特性限制了紫花苜蓿在我國南方地區和氣候過渡帶的推廣和應用。由于地域的限制，我國在紫花苜蓿的研究主要集中在耐寒性、耐鹽性和耐旱性，對其耐熱性研究甚少。耐熱性方面的研究主要集中在生長發育、形態、生理生化、產量和品質等方面。秋眠性是紫花苜蓿種子審定、引種和推廣的重要指標。盧欣石指出紫花苜蓿秋眠性越強，匍匐生長越明顯，植株相對較矮，再生慢，抗寒冷；秋眠性越低，則再生越快，直立生長，抗寒性降低，耐熱性增加。但此結論只屬于理論上的推論，并未得到研究驗證。另外目前已有的研究結果表明，某些高秋眠級的紫花苜蓿耐熱性不好，而‘三得利’和‘德欽’等低秋眠級紫花苜蓿卻表現出較強的耐熱性。

發明內容：

針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供利用SOD酶鑒定紫花苜蓿耐熱性的方法。

本發明的利用SOD酶鑒定紫花苜蓿耐熱性的方法，其鑒定步驟為：

1、植物材料和高溫脅迫處理

供試紫花苜蓿品種為‘德欽’，‘阿爾岡金’(‘Algonguin’，FDR＝2，百綠公司提供)和‘賽迪10’(‘Sardi10’，FDR＝9，百綠公司提供)；設25℃/20℃(晝溫/夜溫)為對照(即高溫脅迫0d)，采用35天持續長期高溫脅迫(35℃/30℃，晝溫/夜溫)的方法進行處理，處理后第7d，14d，21d，28d和35d取完全張開和相同部位的葉片進行分析；

2、SOD活性測定和同工酶電泳及染色

稱取新鮮葉片0.25g，酶液的提取參照趙雁等的方法，SOD活性測定參照Giannopolitis和Ries氮藍四唑比色法，稍有改動；采用Laemmli(1970)不連續非變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳法進行電泳，采用Beauchamp和Fridovich的方法進行SOD活性染色，每個樣品重復電泳和染色6次；

3、RNA的提取與反轉錄

稱取高溫脅迫0d和35d的新鮮葉片各100mg，液氮研磨后采用總RNA提取試劑盒(SGTriEx，SinoGene)進行，以1μgRNA、1μLMgCl2反應緩沖液、1μLDNaseI、RNase-freewater溶解處理，鑒定gDNA以及RNA的純度；反轉錄引物使用Oligo(dT)18，反應60min后得到mRNA的反轉錄產物，-80℃保存；qRT-PCR分析，使用20uL反應體系(2×SGGreenqPCRMix10μL、10μMForwardPrimer0.4μL、10μMReversePrimer0.4μL、ROX0.4μL、cDNA1μL、Water,nuclease-free7.8μL)；反應程序設置：預變性(95℃10min)；變性(95℃15s)、退火(55℃15s)、延伸(72℃45s)，45個循環；脫離(95℃15s、60℃30s、96℃15s)，持續讀取熒光信號獲得溶解曲線；

4、引物序列

根據NCBI公布的基因序列和RNA序列，設計內參ACTIN和SOD引物，交由Sinogenesci公司合成；

5、數據統計分析

同工酶遷移率的計算，遷移率＝酶帶遷移距離/溴酚藍遷移距離；CytCu/ZnSOD、ChlCu/ZnSOD、FeSOD和MnSODmRNA的轉錄量按照2-ΔΔCt方法計算；重復所得數據用Excel分析和做圖、用SPSS進行多重比較、用Photoshop對電泳圖片進行編輯。

本發明的有益效果為：它于人工氣候箱內，模擬自然生境，在35℃/30℃(晝溫/夜溫)條件下，對土培紫花苜蓿成苗進行長期高溫脅迫。通過測定SOD酶活性、同工酶譜和SOD酶的mRNA轉錄水平來鑒定紫花苜蓿的耐熱性，鑒定需要的時間短，結果可靠。

具體實施方式：