[發明專利]卷煙煙氣總粒相物誘導細胞氧化應激GSH/GSSG的測定方法

有效

• 申請號: 201510460904.7
• 申請日: 2015-07-31
• 公開（公告）號: CN105004689B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發明（設計）人: 李翔;張世敏;謝復煒;趙俊偉;尚平平;康彧
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及到卷煙煙氣總粒相物的體外毒理學研究，具體來說是一種檢測卷煙煙氣總粒相物誘導細胞氧化損傷后胞內谷胱甘肽還原態與氧化態比值（GSH/GSSG）的測定方法。

背景技術

卷煙煙氣是一種復雜的混合物，已報道的化學成分超過8000種，并且部分化學成分顯示出一定的氧化性。當細胞或組織暴露在卷煙煙氣中時，細胞體系的氧化/抗氧化平衡被打破，細胞產生氧化應激，并最終導致機體產生病理性損傷。當細胞發生氧化應激時，細胞內活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）增加，會對脂質、蛋白質以及DNA等產生不同程度的氧化損傷，同時激活細胞內抗氧化物質如細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD），還原型谷胱甘肽（GSH），過氧化氫酶等。在這些抗氧化物中，GSH在細胞內發揮重要的抗氧化作用。GSH是細胞內含量豐富的硫醇式縮氨酸，對維持細胞氧化還原平衡發揮重要作用，被廣泛作為細胞氧化應激標志物。針對細胞氧化應激狀態下胞內GSH/GSSG的檢測，用熒光測定法較易于操作，但檢測結果易受干擾；而采用高效液相色譜法分析時，樣品前處理過程耗時長，并且對于大樣品的檢測不方便，所用的柱子也較特殊。當前，較常用的檢測方法是酶循環法，該方法最初由Owen和Belcher提出（Owens CW, Belcher RV. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione. Biochem J. 1965;94:705-711），之后由Tietze（Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem. 1969;27(3):502-522.）和Griffith（Griffith OW. Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal Biochem. 1980;106(1):207-212.）進行了改進。但該方法仍然存在一些不足之處：首先，其特異性不夠高，主要是由于5,5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）可與許多含活性巰基基團的物質反應，同時，檢測的是谷胱甘肽總量，不能區分出GSH和GSSG；此外，該方法對樣品的處理時間要求嚴格，從開始準備樣品到檢測，時間不能超過3分鐘, 否則將影響測定結果。

發明內容

本發明的目的正是針對上述存在的問題對部分操作步驟進行了改進，基于酶循環法建立一種卷煙煙氣總粒相物誘導細胞氧化應激時胞內GSH/GSSG的檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種卷煙煙氣總粒相物誘導細胞氧化應激GSH/GSSG的測定方法，包括以下工藝步驟：

1)配制實驗試劑：包括（1）生長培養液，（2）磷酸緩沖鹽溶液（PBS），（3）1 %的胰酶，（4）三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（SBB），（5）掩蔽劑，（6）脫蛋白質劑，（7）GSSG標準溶液，（8）反應混合液，（9）還原型輔酶Ⅱ（NADPH）溶液，（10）陰性對照；

２）制備卷煙煙氣總粒相物：將捕集有卷煙煙氣總粒相物的劍橋濾片直接放入錐形瓶中，加入適量體積的DMSO，萃取捕集在劍橋濾片上的主流煙氣粒相組分，室溫振蕩20 min，去濾片過濾除菌，制備煙氣總粒相物濃度為10 mg/ml的樣品儲存液，于-80℃保存。

３） 細胞接種培養：細胞進行消化以后，制備細胞懸液，6孔板的所有孔中每孔加入2.0 mL生長培養液 + 450 μL細胞懸液，于37 ℃、5 % CO₂條件下培養24 h；

４）卷煙煙氣總粒相物染毒：用生長培養液將卷煙煙氣總粒相物儲存液調整到不同濃度，終濃度設置至少包括2個非零濃度，使細胞存活率在70 %以上，培養24 h后的細胞，吸去培養液，6孔板中陰性對照組每孔加入2.5 mL 20 μg/mL DMSO生長培養液，實驗組每孔加入2.5 mL含有不同濃度卷煙煙氣總粒相物的生長培養液，于37 ℃、5 % CO₂條件下培養24 h；