[發明專利]一種基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞可視化檢測方法

有效

• 申請號: 201510455700.4
• 申請日: 2015-07-29
• 公開（公告）號: CN105063169A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 梁興杰;劉暢;鄧華;霍帥東;鄒國漳
• 申請（專利權）人: 國家納米科學中心
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N21/29
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯桂麗

技術領域

本發明涉及臨床醫學技術領域，具體涉及一種腫瘤細胞的可視化檢測方法，尤其涉及一種基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞一步法可視化檢測。

背景技術

隨著環境的惡化，腫瘤發病率越來越高，發現不及時常常會錯過最佳治療時機而導致治療失敗。目前臨床診斷方式主要包括成像學檢查、病理組織學檢查和生物標記物檢查等，但這些方法都比較耗時，而且價格昂貴，需要依賴于高端大型儀器設備，無法在腫瘤細胞數量很少時檢測其存在性，因而上述方法既無法有效判斷腫瘤的轉移或復發，也難以及時反映腫瘤治療過程中的療效。因此，目前急需一種成本低、易操作的檢測方法用于癌癥的快速檢測。

核酸適配體(Aptamer)是指人工合成的寡核苷酸，可通過配體指數富集系統進化法(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)從隨機的核酸片段中篩選獲得。與傳統的探針分子(如抗體-抗原)相比，核酸適配體可通過構象折疊特異性識別靶標分子，親和力較高，還具有可高效大量合成，無需從動物體內提取純化等優點。

由于金納米顆粒具有表面等離子共振效應，使其具有獨特的光學特性，常被用來作為比色探針，實現可視化檢測。其檢測原理一般為為：當溶液中的鹽濃度升高時，單分散狀態下的金納米顆粒會受到鹽離子的影響而發生聚集，導致溶液的顏色由深紅色變為藍紫色，同時紫外-可見吸收峰發生藍移。基于此原理也可通過金納米顆粒溶液的顏色變化及紫外-可見吸收光譜的變化來檢測特異性靶細胞的存在。

針對核酸適配體和金納米顆粒的諸多優點，目前也有諸多報道將核酸適配體和金納米顆粒結合起來用于對靶分子的比色檢測。

CN102676508A公開了一種基于納米金和適配體的小分子探針及其制備方法，其采用的小分子探針包括納米金顆粒，以及組裝在納米金顆粒上的一種以上巰基修飾DNA片段，還包括一種以上的熒光基團標記的適配體，且所述的一種以上適配體至少部分片段與所述的一種以上巰基修飾DNA組互補雜交。

CN103529197A公開了一種適配體修飾的納米金探針，采用以直徑為20-30nm的納米金球為內核，金球外表面鍵合有適配體鏈和寡核苷酸鏈。

王文鳳等研究了基于納米金標記-適配體識別的伏馬菌素B1可視化檢測新方法，其采用以納米金為載體，首先在納米金表面組裝巰基化的適配體互補短鏈DNA1/FBI-適配體復合物，當加入目標物是，適配體鏈與目標物結合，與互補短鏈DNA1解離，此時再加入納米金標記的與適配體互補短鏈1互補的短鏈DNA2，二者雜交可導致納米金粒子的聚集而使溶液顏色發生變化，進而實現目標物的可視化檢測(參見“基于納米金標記-適配體識別的伏馬菌素B1可視化檢測新方法”，王文鳳等，食品與生物技術學報，第32卷第5期，第501-508頁，2013)。

上述所涉及到的文獻中，均采用的是將巰基化的核酸適配體共價連接到金納米顆粒表面，這種方法的缺點在于需要復雜的合成過程才能將核酸適配體修飾到金納米顆粒表面，往往需要昂貴的大型儀器設備作為輔助檢測手段。目前也有一些文獻公開了直接利用游離的核酸適配體和金納米顆粒來檢測金屬離子、蛋白質、DNA等小分子，但都存在步驟復雜，操作繁瑣，無法實現快速檢測等不足。

因此，研發一種基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞的快速、高效、簡便的可視化檢測方法是目前亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種腫瘤細胞的可視化檢測方法，特別是一種基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞一步法可視化檢測。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞可視化檢測方法，該方法選擇可特異性識別腫瘤細胞的DNA適配體作為檢測探針，以金納米顆粒的聚集變色特性為檢測指示信號，從而對腫瘤細胞進行可視化檢測；其中，所述的DNA適配體為游離狀態，所述的金納米顆粒為無修飾的金納米顆粒。

本發明所提供的基于核酸適配體和金納米顆粒相互作用的腫瘤細胞可視化檢測方法，具體包括以下步驟：

(1)取10μL濃度為11.5nM的金納米顆粒于200μL的離心管中，加入10μL游離的可特異性識別腫瘤細胞的DNA適配體進行雜交，得到適配體修飾的金納米顆粒溶液；

(2)向上述適配體修飾的金納米顆粒溶液中加入10μL含有待檢測的腫瘤細胞的PBS緩沖液，孵育10-30min，觀察溶液顏色變化。