[發明專利]一種還原型輔酶復合試劑及其應用

有效

• 申請號: 201510450879.4
• 申請日: 2015-07-28
• 公開（公告）號: CN105002263B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 岳彩琴
• 申請（專利權）人: 中生北控生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/48;C12Q1/58
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及生化檢測領域，具體的，涉及一種穩定的還原型輔酶復合試劑及其應用。

背景技術

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，輔酶I)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，輔酶Ⅱ)，這兩種輔酶都有氧化型和還原型兩種形式，氧化型用NAD⁺及NADP⁺表示，還原型用NADH及NADPH表示，其分子中的吡啶環可接受[H⁺]，在脫氫酶的作用下，它們可以傳遞作用物分子的氫。生物體內有許多以NAD⁺或NADP⁺作為輔酶的脫氫酶，NADH和NADPH在340nm處有特異吸收峰，所以臨床檢驗學上廣泛利用NADH和NADPH的特點，作為監測生化反應的指標，用來計算被測物的濃度或者活力，例如，酶法肌酐試劑、門冬氨酸轉移酶試劑、丙氨酸氨基轉移酶試劑、α-羥丁酸脫氫酶試劑、乳酸脫氫酶試劑、尿素測定試劑等；此外，NADH和NADPH可以作為酶循環反應的輔酶參與反應，使反應信號循環放大，提高檢測的靈敏度，例如在總膽汁酸測定技術中，Thio-NAD可以與3α-HSD一起特異性氧化膽汁酸，生成3-酮類固醇和還原性輔酶(NADH)，體系中有一定量的NADH存在時，又反向生成Thio-NAD和膽汁酸，每一次循環比原來的反應提高一倍的靈敏度，如此往復循環，從而放大微量的膽汁酸，產生大量的水溶性非染料的硫代還原型輔酶(Thio-NADH)，最后測定生成的Thio-NADH的吸光度變化，測得總膽汁酸的含量。

中國專利申請CN1179792A提供了一種保持還原型輔酶的方法，該方法是在反應體系中引入一個不干擾測定的化學反應，利用酶和底物將已氧化的輔酶還原成還原型輔酶，使得在存儲過程中還原型輔酶再生，但這種催化反應速度比較慢，實施的成本比較高、某些酶不太容易獲得，且加入的酶本身也存在穩定性的問題。美國專利US5278044提供了一種脂質體包裹來穩定還原型輔酶的方法，該方法主要用于藥物或化妝品的制作，并不適用于臨床診斷試劑。美國專利US5278044提供了用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖體系來穩定NADH的方法，該方法主要特點是pH值為9.5～11.0，其中最佳pH值為10.0～10.4之間，但在實際應用過程中過高的pH值限制了緩沖體系的選擇，且很多酶在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖體中活力會受到影響，這就限制了其應用。中國專利申請CN1311335A提供的pH值為8.5～11.0，溶液中含有0.5～50mM的金屬離子螯合劑的試劑；中國專利申請CN101140279A提供了一種含有緩沖液、穩定劑、有機溶劑、螯合劑和無機鹽的還原型輔酶的復合穩定劑，以上兩種試劑中均含有螯合劑，再加入某些酶時，可能會影響酶的穩定性而限制其應用。

現有的還原型輔酶溶液一般由還原型輔酶、金屬離子螯合劑和緩沖液、無機鹽及有機溶劑等組成，再加入某些酶時，存在穩定時間較短的缺陷，在2-8℃條件下儲存的過程中，穩定性發生變化，這種特性導致其隨著放置時間的延長試劑顏色由無色或淡黃色而逐漸變成紅色，測定結果降低，在應用時影響檢測結果的準確性；2-8℃開蓋使用狀態下，穩定性發生變化，測定結果降低，不能滿足檢測的要求。

因此有必要提供一種新的、穩定性好、可以與某些酶類混合使用的還原型輔酶溶液，用于臨床生化試劑中。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的還原型輔酶溶液在加入某些酶時，存在的穩定時間短的缺陷，提供了一種可穩定還原型輔酶的復合試劑，所述復合試劑的組成成分包括：

還原型輔酶、緩沖液和穩定劑；其中，所述緩沖液選自由2-(環己胺)乙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-1-丙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-2-羥基-1-丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)-3-氨基丙烷磺酸緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液和三乙醇胺緩沖液所組成的組中的一種。

可選的，所述穩定劑選自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白和金屬離子螯合劑所組成的組中的一種或多種。

可選的，在所述復合試劑中還原型輔酶的濃度為0.01-10g/L，優選為0.5-6g/L；緩沖液的終濃度為5-500mmol/L，優選為10-100mmol/L；穩定劑的濃度為0.5-20g/L，優選為3-10g/L。

可選的，所述緩沖液的緩沖容量為0.05-1mol/L。

可選的，所述復合試劑的pH為8.5-10.0。