[發(fā)明專利]用于擴(kuò)增襀翅目昆蟲線粒體COI基因的特異性引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510443567.0
• 申請日: 2015-07-24
• 公開（公告）號: CN104946645A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜予州;陳志騰;陸明星
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/53
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一對用于擴(kuò)增襀翅目昆蟲線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I(cytochrome?c?oxidase?I；COI)基因的特異性引物。

背景技術(shù)

襀翅目(Plecoptera)又稱石蠅，該類昆蟲在除南極以外的世界各大陸上均有分布，但主要分布于東洋區(qū)、古北區(qū)及新北區(qū)，尤以橫跨古北和東洋兩大動(dòng)物地理區(qū)的我國種類最為豐富。襀翅目昆蟲較廣泛地分布在多種類型的水域中，是重要的水質(zhì)監(jiān)測指標(biāo)生物，加強(qiáng)該類群的分類研究，可以更好地為水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測提供服務(wù)。

從系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化學(xué)的角度來看，襀翅目是一個(gè)關(guān)鍵的類群。雖然襀翅目系統(tǒng)發(fā)育被廣泛研究，但仍需要通過其他更多的特征來證明。而通過分子手段獲得的資料將更有助于推斷襀翅目各科間的親緣關(guān)系以及和其他目的親緣關(guān)系。我國有關(guān)襀翅目原顎類昆蟲的研究僅限于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)，分子學(xué)研究目前仍是空白。深入了解襀翅目昆蟲的起源、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對重建襀翅目系統(tǒng)發(fā)育乃至研究昆蟲綱的進(jìn)化關(guān)系都具有重要意義。這就需要借助快速而準(zhǔn)確的分子手段對襀翅目昆蟲進(jìn)行相關(guān)領(lǐng)域的研究。

近年來，利用分子技術(shù)對物種進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種普遍而且有效的方法，其中線粒體COI基因由于具有較高的進(jìn)化速率已成為區(qū)分物種和研究物種進(jìn)化關(guān)系的一種理想基因。因此，利用COI基因?qū)σH翅目昆蟲進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析是一種較好的方法，目前，昆蟲遺傳研究過程中，擴(kuò)增昆蟲線粒體COI基因一般是采用已報(bào)道的通用引物，但由于其通用性較強(qiáng)，特異性較弱，在實(shí)際研究過程中，擴(kuò)增昆蟲COI基因的同時(shí)，也往往能擴(kuò)增出昆蟲體表及體內(nèi)雜菌的COI基因片段且擴(kuò)增片段長度較短。這將導(dǎo)致某些昆蟲，如對襀翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究的作用不理想，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶往往為雙條帶甚至多條帶，測序峰圖多為雙峰。這給對襀翅目昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究分析帶來了阻礙。目前國際上沒有專門針對擴(kuò)增襀翅目昆蟲COI基因的特異性引物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種襀翅目昆蟲線粒體COI基因擴(kuò)增的特異性引物，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。

一對用于襀翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴(kuò)增的引物，其序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明還公開了一種襀翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴(kuò)增方法，是采用上述的引物，用50μl?PCR體系在特定PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。

所述的50μl?PCR體系是：5μl?10×buffer(+Mg²⁺)，2.5μl?dNTP(2.5mM)，3μl引物L(fēng)eCOI-F(10μM)，3μl引物L(fēng)eCOI-R(10μM)，0.5μl?rTaq酶(5μ/μl)，2μl?DNA模板(100ng)，34μl雙蒸水。

所述的PCR擴(kuò)增條件是：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘15秒，51℃退火溫度1分鐘15秒，72℃延伸1分鐘5秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

本發(fā)明根據(jù)襀翅目COI基因序列較保守和非特異性擴(kuò)增引物擴(kuò)增效率低的特性，通過比對襀翅目不同科物種的COI基因序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物。采用本發(fā)明的襀翅目線粒體COI基因的擴(kuò)增引物，可以有效地?cái)U(kuò)增出襀翅目不同科物種的COI基因序列，填補(bǔ)了襀翅目COI基因沒有專門的擴(kuò)增引物的空白，對襀翅目不同科和屬的昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的COI測序，準(zhǔn)確鑒定某些形態(tài)上難于鑒別的近緣物種，為我國襀翅目昆蟲的分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理種群鑒別提供了重要工具。本發(fā)明涉及的擴(kuò)增引物較過去通用引物有較大的優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為：本引物能有效擴(kuò)增出近2000bp的COI基因片段，完全覆蓋COI基因全長，而過去通用引物有效擴(kuò)增長度一般為500-800bp，且擴(kuò)增片段大多為保守區(qū)域，不利于上述研究的數(shù)據(jù)分析。利用本引物對襀翅目昆蟲進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，能顯著降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明引物對襀翅目9科昆蟲COI基因的擴(kuò)增效果圖。1為卷襀；2為鈕襀；3為扣襀；4為鉤襀；5為襟襀；6為新襀；7為刺襀；8為網(wǎng)襀；9為綠襀。

圖2是通用引物對襀翅目9科昆蟲COI基因擴(kuò)增效果圖。1為卷襀；2為鈕襀；3為扣襀；4為鉤襀；5為襟襀；6為新襀；7為刺襀；8為網(wǎng)襀；9為綠襀。

具體實(shí)施方式