[發明專利]來自海洋的芽孢桿菌ZE01及其產低溫淀粉酶的方法

有效

• 申請號: 201510436666.6
• 申請日: 2015-07-23
• 公開（公告）號: CN104962503B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 王淑軍;呂明生;田徑;王小貝;房耀維;劉姝
• 申請（專利權）人: 淮海工學院;連云港杰瑞自動化有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/28;C12R1/07
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所32255
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及一種微生物，特別是一種分離自中國江蘇省連云港海域海泥的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ZE01；本發明還涉及該菌株產低溫淀粉酶的方法。

背景技術

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是指一類作用于淀粉分子，從分子內部切開α-1，4糖苷鍵，生成糊精和還原糖的水解酶，產物末端葡萄糖殘基C1碳原子為α-構型，故稱α-淀粉酶。淀粉酶廣泛應用于食品、醫藥、洗滌、造紙、紡織及皮革等領域。低溫淀粉酶一般來源于低溫微生物，通常情況下，在相對較低溫度范圍內，低溫淀粉酶的活性比相應的嗜溫淀粉酶要高。目前研究的淀粉酶主要是中高溫淀粉酶，這些酶只有在較高溫度下才具有較好的催化活性，因而耗費能量巨大，如果采用低溫淀粉酶則可以節約能量，降低生產成本，符合我國國情，研究前景廣闊，逐漸成為人們研究開發的熱點。因此從海洋環境中篩選高產低溫α-淀粉酶的菌株，是今后研究和開發低溫淀粉酶的關鍵。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的能產低溫淀粉酶的來自海洋的芽孢桿菌ZE01。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供上述芽孢桿菌ZE01產低溫淀粉酶的方法。

本發明的特征包括來自海洋的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ZE01菌株本身（以下稱菌株ZE01），以及利用該菌株發酵生產低溫淀粉酶的方法。

本發明所涉及的菌株ZE01是在中國江蘇省連云港海域的海泥中分離到的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ZE01，該菌株已于2015年1月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.10375。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，聯系電話：[phone]。

以下對本發明進行詳細的闡述。

一、本發明菌株ZE01的形態特征與生理生化特征。

1.1形態特征：

菌株ZE01為革蘭氏陽性芽孢桿菌(見圖1)；在2216E固體培養基中培養24h后，菌落呈乳白色，表面干燥，有皺褶。在淀粉篩選培養基培養48h后,加碘液后能產生明顯的透明圈 (見圖2)。

1.2生理生化特征:

該菌株VP、明膠酶實驗、葡萄糖氧化實驗呈陽性，β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶、脲酶實驗呈陰性，不利用檸檬酸，不產生硫化氫和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，生理生化結果見表1。

表1 菌株ZE01的生理生化特征

注: +: 陽性; ?: 陰性

1.3菌株ZE01的序列的擴增和分析：

用Generay試劑盒提取得到ZE01的基因組，選用擴增原核微生物16S rDNA序列的通用引物（27F :5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）于PCR mix體系中反應。反應體系：PCR mix（46μL），上下游引物（各1μL），DNA模板（2μL）。反應程序：94 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 S，54 ℃退火30 S，72 ℃延伸90 S，32個循環；72 ℃ 10 min。將PCR電泳純化回收并構建克隆載體，選陽性克隆子提取質粒送至南京思普金生物科技有限公司測序，將測得序列互補反相拼接后，獲得的1262bp堿基片段序列，用MEGA5軟件進行16S rDNA序列的比對分析，并構建系統發育樹（如圖3），將該序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，結果發現與芽孢桿菌屬（Bacillus）最接近。

二、本發明菌株ZE01的生長特性

本發明提供的菌株ZE01，對其生長特性進行了細致的研究，基本摸清不同條件下該菌的生長情況。

2.1本發明中涉及的培養基：

2216E培養基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陳海水配制，pH8；

淀粉篩選培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，可溶性淀粉0.2%，陳海水配制，pH8.0；

產酶培養基：甘油0.5%，玉米淀粉0.5% 氯化銨0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

2.2種子液的制備：將菌株ZE01斜面種子接種到2216E培養基中, 30℃, 180 r/min, 裝液量20%, 培養16 h。

2.3培養時間對菌株ZE01生長的影響：