[發(fā)明專利]一種固液兩相PEG培養(yǎng)基的制備方法及應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2015-07-22
• 公開（公告）號: CN105145350B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭寶太;宋志成;牛倩雅;孟慶芹;趙春梅;王晶珊;李廣存
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G9/10;A01G7/00
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標事務(wù)所有限公司37101
• 代理人: 崔濱生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物抗旱性研究領(lǐng)域，具體涉及一種固液兩相PEG培養(yǎng)基的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，也是我國潛在的主糧，且具有蔬菜、糧食兼用的特點。馬鈴薯的生長需要大量水分，缺水與鹽脅迫對其影響很大，干旱等逆境脅迫是馬鈴薯生產(chǎn)的重要限制因子，其抗旱等逆性研究具有重要價值。

Bansal等(1991年)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯葉圓盤對PEG6000(聚乙二醇，分子量為6000)溶液的抗性表現(xiàn)與供體品種的抗旱性一致，大分子量PEG可作為馬鈴薯抗旱性的篩選劑與測定劑。實際上，大分子量PEG不進入細胞，是包括馬鈴薯在內(nèi)的植物抗旱性測定的最佳篩選劑，應(yīng)用最普遍。甘露醇等小分子物質(zhì)也可作為滲透脅迫劑，但進入細胞內(nèi)部，甚至參與代謝，其作用無法與PEG相比。

以馬鈴薯試管苗為材料，可以采用液體PEG培養(yǎng)基測定抗旱性，但采用液體PEG培養(yǎng)基的具有如下缺陷：1)很難使供試材料保持直立，特別是體積微小的材料。2)液體PEG中，植物對模擬旱脅迫的生理反應(yīng)是否與土壤旱脅迫下的生理反應(yīng)是否一致，尚無研究。

采用含PEG的MS固體培養(yǎng)基測試抗旱性，不受莖段大小的限制，試管苗莖段都可保持直立，莖葉與根都能正常生長，可看到脅迫條件下莖段生長的全過程，抗旱性特點表現(xiàn)充分。固體PEG中，試管苗對模擬旱脅迫及鹽脅迫的生理反應(yīng)與土壤旱脅迫下的生理反應(yīng)一致，結(jié)果更具說服力。

現(xiàn)有技術(shù)中有兩種固體PEG培養(yǎng)基已經(jīng)用于馬鈴薯試管苗的抗旱性測定：

第一種：普通固體PEG培養(yǎng)基，是將PEG加入到普通MS培養(yǎng)基中，高壓滅菌后冷卻成為固體PEG培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)基具有制備方法簡單，材料接種方便的特點。但是如果培養(yǎng)基中PEG的濃度超過8％，會抑制瓊脂凝膠的形成，也就是說不能通過該方法直接配制出高濃度固體PEG培養(yǎng)基。而低濃度普通固體PEG培養(yǎng)基上，不能表現(xiàn)出從脅迫見效到作用明顯，直至完全抑制試管苗生長的完整表現(xiàn)，遠遠達不到測定馬鈴薯試管苗抗旱性的要求，特別是達不到抗旱性品種篩選的要求，因此該普通固體PEG培養(yǎng)基的應(yīng)用受到了極大地限制。

第二種：垂直滲透法固體PEG培養(yǎng)基。Van der Weele等(2000年)報道了一種新方法：在固體MS平板上加等體積PEG溶液，經(jīng)過24h滲透平衡，倒掉液體并晾干后便可獲得含不同濃度PEG的固體培養(yǎng)基。其原理是上層的PEG溶液滲入下層固體MS凝膠中，稱之垂直滲透法，該法是配制高濃度PEG固體培養(yǎng)基的經(jīng)典方法。但是垂直滲透法固體PEG培養(yǎng)基的缺點明顯：1)培養(yǎng)基制作步驟復(fù)雜，所需時間長達24h或更長；2)容易出現(xiàn)培養(yǎng)基的污染；3)PEG的濃度在固體凝膠中從上到下呈梯度遞減分布，試管苗根部感受的PEG濃度不均勻；4)培養(yǎng)基的單次制作占用超凈臺空間大，占用時間長，不能隨做隨用。

國內(nèi)外，馬鈴薯抗旱性機理及抗旱性改良的研究還比較薄弱，這與馬鈴薯抗旱性研究方法有效性差，特別是試管苗抗旱性測定方法不夠簡便有直接關(guān)系。直接用垂直滲透法固體PEG培養(yǎng)基研究試管苗抗旱性的報道很少，如Anithakumari等(2011)用垂直滲透法制作PEG固體培養(yǎng)基(滲透時間3d)，并進行了馬鈴薯試管苗的抗旱性測定；鄧珍等(2014)用垂直滲透法制作的PEG固體培養(yǎng)基(滲透時間48h)，測定了11個品種株高等生長指標，并對相對指標值進行了聚類分析，未見該種培養(yǎng)基用于馬鈴薯試管苗抗旱性研究的其他報道。

針對馬鈴薯試管苗，陸續(xù)有利用小于8％的低濃度PEG固體培養(yǎng)基或用甘露醇作為測定劑研究抗旱性的報道，即使是轉(zhuǎn)基因苗也不用固體PEG直接測定其抗旱性，這都是高濃度普通固體PEG使用受限、垂直滲透法使用不便所導(dǎo)致的。因此對固體PEG培養(yǎng)基進行改進是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

為解決高濃度普通固體PEG使用受限、垂直滲透法使用不便的技術(shù)問題，本發(fā)明特別設(shè)計了一種水平滲透的固液兩相PEG培養(yǎng)基。

本發(fā)明的一種固液兩相PEG培養(yǎng)基的制備方法，是在培養(yǎng)瓶底部配置固體MS培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻形成固體凝膠，沿垂直方向移出部分固體凝膠，在培養(yǎng)瓶底部形成空缺，在所述空缺處加入含PEG的MS液體培養(yǎng)基，所述加入的含PEG的MS液體培養(yǎng)基的體積與移出的固體凝膠的體積相同。

優(yōu)選的，所述沿垂直方向移出部分固體凝膠是沿培養(yǎng)瓶直徑移出一半體積的固體凝膠。

優(yōu)選的，所述含PEG的MS液體培養(yǎng)基中PEG的重量體積比濃度為0-25％。

優(yōu)選的，所述MS培養(yǎng)基中含2-4％蔗糖，0.6-1.5％瓊脂粉，均為重量體積比。