[發(fā)明專利]一種蘋果酸酶基因RKME1及其重組表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510434176.2
• 申請(qǐng)日: 2015-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105002192B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張琦;崔錦錦;張慧君;季秀玲;魏云林;林連兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/63
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蘋果酸酶（Malic enzyme）基因及其重組表達(dá)載體，具體涉及以紅冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 cDNA為模板，擴(kuò)增得到編碼蘋果酸酶（ME）的基因RKME1，將其連接至表達(dá)載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化重組蛋白，并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行了酶活測(cè)定。屬于微生物基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蘋果酸酶（malic enzyme，ME）是調(diào)控蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶，可以催化蘋果酸進(jìn)行氧化脫羧為丙酮酸和CO₂，同時(shí)伴隨著NAD(P)⁺的還原；蘋果酸酶普遍存在于生物體內(nèi)；根據(jù)輔酶因子的不同，蘋果酸酶可分為兩種：NAD-蘋果酸酶（NAD-Malic enzyme；NAD-ME；EC 1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-蘋果酸酶（ NADP-Malicenzyme；NADP-ME；EC 1.1.1.40 。本發(fā)明主要是針對(duì)NADP- 蘋果酸酶）基因進(jìn)行研究。

通常認(rèn)為，NADP-ME為各種細(xì)胞組分的合成提供還原力NADPH。例如在產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控中，NADP-ME持續(xù)為脂肪酸合成酶進(jìn)行鏈延伸提供NADPH（Song Y D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-蘋果酸酶在植物的生長(zhǎng)代謝及發(fā)育過(guò)程中也扮演著重要角色，植物中蘋果酸酶的底物和產(chǎn)物參與多種代謝途徑，包括光合作用和呼吸作用。如熱帶C₄植物中的固碳作用，保持植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的pH 和保持植物根系的離子吸收平衡起重要作用，是生物體生命活動(dòng)中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被認(rèn)為參與植物防御反應(yīng)。另有報(bào)道表明，NADP-ME 參與了果實(shí)的成熟，通過(guò)蘋果酸代謝來(lái)平衡細(xì)胞內(nèi)的pH，還通過(guò)代謝提供碳源和NADPH 調(diào)節(jié)一些底物及輔助因子來(lái)參與脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代謝途徑（CAM）植物的一種重要脫羧酶，酶活性晝高夜低；兼性CAM植物隨著C₃光合型向CAM型轉(zhuǎn)化，其NADP-ME酶活性涿漸升高，干旱誘導(dǎo)CAM植物其NADP-ME酶活性比C₃增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性調(diào)節(jié)中起重要作用。在CAM運(yùn)行和調(diào)節(jié)中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一樣，具有重要調(diào)節(jié)作用(王晨，西北植物學(xué)報(bào)，1997，17（2）: 200-204.)。

蘋果酸酶作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，也可應(yīng)用于厭氧混合酸的發(fā)酵工程及釀酒工業(yè)。因此本發(fā)明通過(guò)發(fā)掘高效、特異性新基因蘋果酸酶MI3410ME1，與pET-32a(+)質(zhì)粒進(jìn)行重組，并實(shí)現(xiàn)在E.coli BL21中表達(dá)。為蘋果酸酶應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從紅冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分離的蘋果酸酶基因RKME1及該基因編碼的氨基酸，或與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長(zhǎng)為1623bp（堿基），其中1-1623為編碼蘋果酸酶成熟多肽的開(kāi)放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有蘋果酸酶基因RKME1的重組表達(dá)載體pET32a RKME1，該重組表達(dá)載體是將SEQ ID NO:1所示基因直接與載體pET32a（+）所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明另一目的是提供一種含有上述的蘋果酸酶基因RKME1或上述的重組表達(dá)載體的宿主表達(dá)細(xì)胞。