[發明專利]不同烷基鏈長的雙核釕配合物作為細胞中的溶酶體探針

有效

• 申請號: 201510433722.0
• 申請日: 2015-07-23
• 公開（公告）號: CN105062463B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 王克志;劉平;吳寶燕;張玉琦
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07F15/00;G01N21/64;C12Q1/02
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技術領域

本專利屬于熒光生物分子探針領域，涉及雙核釕配合物在靶向檢測癌細胞溶酶體細胞器熒光探針等相關領域中的應用。

背景技術

溶酶體是真核細胞內的一種酸性細胞器，負責細胞的消化、降解功能，溶酶體在細胞各種生命活動，包括物質代謝、細胞膜循環、細胞凋亡中發揮著重要作用(P.Saftig,J.Klμmperman,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2009,10,623–635；G.Kroemer,M.Jaattela,Nat.Rev.Cancer 2005,5,886–897；M.E.Gμicciardi,M.Leist,G.J.Gores,Oncogene2004,23,2881–2890)。如果它發生功能紊亂，會引發諸如腫瘤、炎癥、矽肺等多種疾病的產生(Fehrenbacher,N.；Jaattela,M.Cancer Res.2005,65,2993–2995)。溶酶體熒光探針能夠實現對溶酶體的標記，標記溶酶體位置，直觀地監測溶酶體在生理、病理過程中的動態變化，對于深入地理解溶酶體參與生命活動的分子機制，而且對疾病的治療具有重要的指導意義。因此，研究、開發溶酶體熒光探針具有重要的理論意義及實際應用價值。本文中共提及三個雙核釕配合物可用作溶酶體熒光探針，其中配合物Ru2已經報道于文獻(Liu,P.；Liu,J.；Zhang,Y.-Q.；Wu,B.-Y.；Wang,K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015,143,89-99)，但只討論了其細胞吸收的性質并沒有研究其在細胞中的具體定位，本發明應用了細胞核、線粒體、溶酶體三種染料和三個配合物進行共同染色，在共聚焦顯微鏡下觀察到了三個不同烷基鏈長的雙核釕配合物定位于細胞中的溶酶體。目前具有溶酶體定位能力的雙核釕配合物熒光探針還未見報道，該研究為開發雙核釕配合物類溶酶體熒光探針提供了有意義的探索。

發明內容

本發明的目的是制備三種不同長度烷基鏈的雙核釕配合物，應用了MTT法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽比色法)和高內涵分析法探究了三個配合物對細胞的毒性，并通過熒光共聚焦方法對三種配合物進行了共定位成像研究，以Hoechst 33342(三氯化氫2-(4-乙基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5-二-1H-苯并咪唑)、Mitotracker green、LysoTracker green三種熒光探針為標準物，經過共定位分析，證實三種配合物在癌細胞中能實現對溶酶體的標記。

本發明的技術方案如下：

本發明采用的三種雙核釕配合物的配體用L1，L2，L3表示，三種配合物用Ru1，Ru2，Ru3，代表，結構如下：

上述雙核釕配合物的合成途徑如下圖所示：

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：

目前已經發現的大多數探針缺乏特異的靶向性,且不能提供客體分布的定量信息。迫切需要開發出具有細胞器定位功能以及能夠反映客體分布的熒光探針本發明合成的三種配合物與活細胞共同培養即可進入活細胞內，進而特異性地進入細胞內的溶酶體這一細胞器，導致溶酶體的的熒光強度顯著增強，進而用于癌細胞內溶酶體生理活動的監測。同時釕配合物相比于傳統溶酶體熒光探針還具有光化學性質穩定、消光系數大、熒光壽命長和斯托克位移大等特點。且本發明第一次使用了高內涵分析的方法來檢測配合物藥物的細胞毒性，高內涵提供了一種靈敏度高、操作簡便、使用安全的細胞增殖與活性檢測方法，與傳統的MTT實驗相比具有明顯的優勢。

附圖說明

圖1HeLa細胞在不同濃度的配合物Ru1-Ru3孵育48h后的細胞活性圖

圖2HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小時后,用Hoechst 33342染色30分鐘后共聚焦圖片

圖3HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小時后,在Mitotracker green和Hoechst 33342中染色30分鐘后共聚焦圖片

圖4HeLa細胞在濃度為20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小時后,在Lysotracker green和Hoechst 33342中染色30分鐘后共聚焦圖片

具體實施方式

實施例1：配體L1、L2、L3和三個釕配合物的制備