[發明專利]一種用于廢水中生物降解的二元復合菌群構建方法

有效

• 申請號: 201510423726.0
• 申請日: 2015-07-18
• 公開（公告）號: CN105062911B
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 郭靜波;姜麗杰;王偉卓;劉明偉
• 申請（專利權）人: 東北電力大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F3/34;C12R1/05;C12R1/01;C12R1/40;C02F101/38;C02F101/34
• 代理公司: 吉林市達利專利事務所 22102
• 代理人: 陳傳林

1.一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復合菌群的構建方法，其特征在于：它包括以下內容：

1)選擇菌株：選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌，惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌均來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，惡臭假單胞菌的菌株編號為CGMCCNo.1.1003，乙酸鈣不動桿菌的菌株編號為CGMCC No.1.3615，將惡臭假單胞菌的菌株簡稱為BA1、乙酸鈣不動桿菌的菌株簡稱為BA2；

2)菌株的活化：從營養肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養24h進行菌株的活化；

3)菌株的馴化：取活化后的BA1和BA2培養液各10mL，分別接種于含有苯胺的馴化培養基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養，進行菌株的馴化，培養36h后再重復上述過程進行第二個周期的馴化，共馴化5個周期，180h，前兩個馴化周期加入1.5mL經過濾除菌的質量體積比為10％的苯胺溶液，第三個周期加入3.0mL經過濾除菌的質量體積比為10％的苯胺溶液，最后兩個馴化周期加入8mL經過濾除菌的質量體積比為10％的苯胺溶液；

4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單菌落接種到斜面培養基上，待菌苔長出后放入4℃冰箱中低溫保存備用；

5)菌落形態觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基中，置于30℃生化培養箱中培養24h后，觀察其菌落形態，主要通過菌落的顏色、透明度、表面光滑性和邊緣形態對用于苯胺生物降解的二元復合菌群構建的BA1和BA2菌株進行區分；

6)菌懸液制備：將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養24h，將培養液置于臺式高速冷凍離心機中以10000rpm離心5min后，棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液重懸，再次離心后棄去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.1mol/L,pH8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖溶液重懸，分別制成OD₆₀₀＝1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時通過平板計數法分別測定菌懸液中BA1和BA2的活菌數；

7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備：根據菌懸液中測定的BA1和BA2活菌數，吸取BA1和BA2的菌懸液，使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為2×10⁸CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表體系中僅有BA1，0/10代表體系中僅有BA2；

8)二元復合菌群最佳配比的選擇：將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以體積體積比為10％的量分別接種于含苯胺300mg/L的無機鹽培養液中，于30℃，150rpm搖床中振蕩培養36h后測定殘留的苯胺和TOC濃度，同時通過倍比稀釋法依據菌落形態特征對生物降解反應結束后體系中BA1和BA2的數量進行計量；定義CFU_BA1為BA1在10/0體系中的活菌數，即僅接種BA1的體系，CFU_BA2為BA2在0/10體系中的活菌數，即僅接種BA2的體系，CFU_BA1·BA2為BA1在BA2存在時的活菌數，CFU_BA2·BA1為BA2在BA1存在時的活菌數，BA1的相對活菌數BA2的相對活菌數當RCFU＜1時，代表一株菌生長和繁殖受到了另一株菌的抑制，而當RCFU＞1時，代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進作用；根據兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU計算結果，選擇苯胺降解率、TOC降解率最高且RCFU_BA1和RCFU_BA2計算結果均大于1的初始活菌比例作為苯胺生物降解二元復合菌群的構建比例，此時二元復合菌群對苯胺的降解效果最佳且形成了互利共生的關系。