[發明專利]一種羊草磷酸丙糖異構酶基因及其編碼蛋白與應用

在審

• 申請號: 201510423530.1
• 申請日: 2015-07-17
• 公開（公告）號: CN104975035A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 崔繼哲;劉欣;盧倩;趙春梅;李若男;張寶懿;孟雪
• 申請（專利權）人: 哈爾濱師范大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 牟永林

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種羊草磷酸丙糖異構酶基因及其編碼蛋白與應用。

背景技術

全球范圍內作物的減產主要是由鹽堿、干旱、重金屬毒害、極端溫度等非生物脅迫因子所致。所有這些逆境脅迫都會引發機體代謝的失衡，使細胞內累積過量的甲基乙二醛(MG)和活性氧(ROS)，對植物造成次級氧化脅迫。關于抗氧化脅迫作用，過去更多地關注抗氧化酶和非酶抗氧化劑對ROS的清除。然而，逆境脅迫下，機體內MG是ROS大量爆發的重要原因，ROS和MG在體內的代謝途徑、及其清除系統密切相關。MG為活性羰基類物質，生理條件下，MG主要通過糖酵解、糖異生和光合作用中間物磷酸丙糖的非酶促降解產生。脅迫條件下，糖代謝途徑的平衡被打破，磷酸丙糖極不穩定，形成大量MG。MG能與蛋白質、脂質和核酸互作，高濃度下，MG會使得機體中關鍵的抗氧化防護系統失活，對植物細胞產生極大的毒害。同時，MG通過與蛋白質發生非酶促糖基化反應能夠生成晚期糖基化終產物(AGEs)，在這一過程中會大量生成活性氧自由基。因此，有效地降低逆境脅迫下形成的過量MG應當是提高植物抗逆性最重要策略之一。

磷酸丙糖異構酶(TPI)是糖代謝中催化3-磷酸甘油醛(GAP)和磷酸二羥丙酮(DHAP)之間相互轉化的一個酶，可通過直接或間接的方式參與生物體內的糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑、脂肪酸的生物合成及光合作用中CO₂的固定等，在碳代謝中占有重要的位置。TPI的活性降低會使DHAP的水平升高，DHAP會自發地轉變成MG。因此分離TPI基因，應用于作物的抗逆分子育種中，可通過降低逆境脅迫下過量MG的形成而提高植物的抗逆性。

發明內容

本發明目的是為了解決植物的抗逆性低的問題，而提供一種羊草磷酸丙糖異構酶基因及其編碼蛋白與應用。

本發明羊草磷酸丙糖異構酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。

本發明羊草磷酸丙糖異構酶基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明羊草磷酸丙糖異構酶基因的應用：羊草磷酸丙糖異構酶基因導入目的植物中培育出抗逆性增強的轉基因植物。

本發明從羊草中分離出磷酸丙糖異構酶基因，命名為LcTPI；LcTPI基因由1053個堿基組成，包含5’端非翻譯區(1-77)、蛋白質編碼區(78-836)和3’端非翻譯區(837-1053)。LcTPI基因的編碼蛋白由253個氨基酸組成，分子量是26.9KD,等電點是5.57。

本發明提供的LcTPI基因，其表達受中性鹽、堿性鹽或PEG模擬干旱誘導，可以參與羊草對多種逆境脅迫的響應，提高植物的抗逆性。LcTPI基因導入目的植物中培育出抗逆性增強的轉基因植物，這對于培育抗逆性特別是抗甲基乙二醛和NaCl提高的植物品種具有重要意義，為采用基因工程技術提高植物的抗逆性奠定了物質基礎。

附圖說明

圖1是實施例步驟2進行PCR擴增得到的LcTPI的cDNA?PCR產物的凝膠電泳圖，其中，泳道M為DL2000DNA?Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道1和2為保守區PCR擴增產物；

圖2是實施例步驟3得到的LcTPI的cDNA?3’末端PCR產物的凝膠電泳圖，其中，泳道M為DL2000DNA?Marker，泳道1和2為一輪PCR產物稀釋50倍和100倍的PCR擴增產物；

圖3是實施例步驟4得到的LcTPI的cDNA?5’末端PCR產物的凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000DNA?Marker，泳道1和2為二輪PCR產物稀釋50倍的PCR擴增產物；

圖4是實施例步驟5PCR擴增LcTPI基因全長cDNA的凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000DNA?Marker，泳道1和2為PCR擴增產物；

圖5是實施例步驟6PCR擴增LcTPI基因開放讀碼框(ORF)的凝膠電泳圖，其中，泳道M為DL2000DNA?Marker，泳道1為PCR擴增產物；

圖6是實施例中獲得潮霉素抗性擬南芥轉化苗的生長情況圖；

圖7是實施例中野生型擬南芥和轉LcTPI擬南芥陽性苗在MG脅迫和沒有脅迫處理的生長情況圖，其中1表示野生型未脅迫植株的生長情況，2-4表示轉基因植株未脅迫下的生長情況，5表示野生型擬南芥經MG脅迫的生長情況，6-8表示轉基因植株經MG脅迫的生長情況；