[發(fā)明專利]檢測人EGFR基因突變的引物和探針體系及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510422291.8
• 申請日: 2015-07-17
• 公開（公告）號: CN105177118B
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳曉琦;蔣晶;張傳雷;李妍妍;鄭玉玲
• 申請（專利權(quán)）人: 陳曉琦
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 河南科技通律師事務(wù)所41123
• 代理人: 樊羿,韓松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測人EGFR基因突變的引物和探針體系及試劑盒。

背景技術(shù)

大量研究表明，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）人群中40%左右的患者攜帶表皮生長因子受體（EGFR）基因的體細(xì)胞突變，這些突變與絡(luò)氨酸激酶抑制劑（TKIs）療效有明確的相關(guān)性，如易瑞沙（Iressa）和特羅凱（Tarceva）等藥物。其中，不含T790M突變，但攜帶EGFR基因其它位點突變的NSCLC患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時療效顯著，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)EGFR外顯子20上的T790M位點為耐藥位點，會抑制易瑞沙和特羅凱等藥物的療效。

EGFR基因位于7號染色體上，包含28個外顯子，其酪氨酸激酶功能區(qū)由18～24外顯子編碼，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的EGFR基因突變主要發(fā)生在18～21外顯子，其中以19外顯子上的缺失突變和21外顯子上的點突變居多；主要突變類型包括18外顯子上的點突變（G719X）約占5%，19外顯子上的缺失突變（主要位于747～750位氨基酸）約占45%，20外顯子上的插入突變約占1%，20外顯子上的耐藥點突變（T790M）約占5%，21外顯子上的點突變（L858R和L861Q）約占40～45%。

目前的基因突變檢測方法如突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、TaqMan技術(shù)等，雖然廣泛應(yīng)用在臨床檢測工作中，但是其聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物存在以下缺點：(1)特異性不好，診斷基因突變位點設(shè)計引物容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響檢測效率和準(zhǔn)確性；(2)選擇性不好，在高濃度野生型背景下，檢測低拷貝能力較差；(3)敏感性和分辨率較差，受到引物設(shè)計的限制，導(dǎo)致檢測的敏感性差，分辨率不高。

隨著基因時代的開啟，分子診斷技術(shù)在臨床輔助診斷中扮演越來越重要的角色，如SNP、基因突變等檢測逐步應(yīng)用于臨床的輔助診斷和個性化用藥。核酸檢測技術(shù)（nucleic acid amplification testing，NAT）包含兩種擴(kuò)增方式：對靶核酸直接擴(kuò)增和信號擴(kuò)增。對靶序列的擴(kuò)增又可以分為等溫擴(kuò)增（isothermal amplification，IA）和聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。等溫擴(kuò)增技術(shù)包含：轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法TMA (transcription mediated amplification)、NASBA（Nucleic acid sequence-based amplification）、SDA（strand displacement amplification）等。

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（transcription mediated amplification，TMA）由Dr.Larry Mimms發(fā)明，并且其公司Gen-Probe 2004年因此獲得美國國家技術(shù)獎（National Medal of Technology）。TMA反應(yīng)體系需要兩種酶的共同作用：鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Moloney murine leukemia virus，MMLV）和T7 RNA多聚酶；在42°C恒溫條件下來擴(kuò)增DNA或RNA的反應(yīng)系統(tǒng)。擴(kuò)增原理為：在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，目標(biāo)序列以引物為引導(dǎo)來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在雜合鏈上的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解以后，合成雙鏈的DNA；且在T7 RNA多聚酶的作用下，轉(zhuǎn)錄出數(shù)以萬計的目標(biāo)RNA序列，所轉(zhuǎn)錄出的RNA可以作為模板來進(jìn)行下一個循環(huán)，整個反應(yīng)過程是一個自催化過程。

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）的擴(kuò)增原理與TMA擴(kuò)增原理相似，但在提取核酸和產(chǎn)物擴(kuò)增檢測的方法上存在不同，這兩種擴(kuò)增方法的靈敏度較高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件相對簡單、擴(kuò)增效率高，均無需專門的擴(kuò)增儀器。TMA和NASBA，由于其高效的擴(kuò)增能力，廣泛用于血液中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和艾滋病毒（hepatitis I virus，HIV）的篩查，但是其擴(kuò)增基因突變和SNP的能力尚未得到驗證。