[發明專利]綠殼蛋雞啄羽相關基因檢測用試劑盒及其實現方法

在審

• 申請號: 201510420030.2
• 申請日: 2015-07-17
• 公開（公告）號: CN104975097A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 姚俊峰;王曉亮;楊長鎖;王敏
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種綠殼蛋雞啄羽相關基因檢測用試劑盒，其特征在于，包括：

1)用于PCR擴增以檢測rs13640917基因用的引物對，即上游引物U和下游引物D，其中：

U如Seq?ID?No.1所示，即：5’‐CACAATGACCACGACAACG‐3’；

D如Seq?ID?No.2所示，即：5’‐ATCTCACGGAACCCAAATG‐3’；

2)限制性核酸內切酶AcuI，其序列為：

5’‐CTGAAG(N)16↓‐3’以及3’‐GACTTC(N)14↑‐5’

其中箭頭所指位置為酶切位點，N表示任何堿基。

2.一種根據權利要求1所述試劑盒的實現方法，其特征在于，對待測雞只的包括rs13640917C/T突變在內的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，再用限制性核酸內切酶AcuI酶切所得的PCR擴增產物，電泳檢測所得到的酶切產物并判斷待測雞只的rs13640917位的脫氧核糖核苷酸是野生型C或突變型T。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的判斷具體為：當電泳顯示為兩條帶，即酶切產物為106bp和295bp兩個片段，表示所述待測雞只的基因型為CC，是野生型純合體；當電泳顯示為一條帶，即酶切產物為401bp一個片段，表示所述待測雞只的基因型為TT，是突變型純合體；當電泳顯示為三條帶，即酶切產物為106bp、295bp及401bp三個片段，所述待測雞只的基因型為CT，是雜合體。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增，其擴增體系包括：雞基因組DNA50ng、上、下游引物10pmol/L各0.3μL、Taq?Mix7.5μL，并用ddH₂O補充反應體系至15μL；PCR反應條件為：95℃變性5min；循環程序為95℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸10min。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的酶切，其反應體系包括：PCR反應混合物4μL、10×酶切緩沖液1μL、內切酶AcuI10U/μL0.4μL、ddH₂O4.6μL，反應體系總體積10μL；通過恒溫水浴37℃孵育1小時。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的電泳檢測是指：對酶切產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電壓8V/cm，時間30min的電泳，并通過凝膠成像系統觀察結果。