[發(fā)明專利]一種全基因組外顯子序列捕獲探針的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510419231.0
• 申請(qǐng)日: 2015-07-16
• 公開（公告）號(hào): CN104962552A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明珍;吳寧;錢嘉林;馬媛媛;武慧娟;錢春燕;李麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市理化分析測(cè)試中心
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 郎堅(jiān)

1.一種全基因組外顯子序列捕獲探針的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)提取正常血液中的總RNA，提取并打斷mRNA；

(2)用SuperScriptⅡ(invitrogen)合成一鏈cDNA；

(3)合成invitrogen的二鏈合成混合液合成cDNA；

(4)補(bǔ)平末端，并在產(chǎn)物末端加A，連接接頭；

(5)富集DNA片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟(1)打斷mRNA的方法為：

用無(wú)核酸酶超純水稀釋總RNA，按1:1體積比(反應(yīng)體系是50μL))加入純化磁珠(RNA?Purification?Beads?15026778?illumina)，在65℃孵育5min，放在磁力架上(DynaMag-2?invitrogen)室溫下孵育5min后，吸棄上清液，

從磁力架上拿下，按5：2體積比加入200μL洗脫液(150mM?LiCl，20mM?Tris?HCl(pH?7.5)，1.0mM?EDTA，0.01％Triton?X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2?invitrogen)室溫下孵育5min后，吸棄上清液，

從磁力架上拿下，加入50μL洗脫液(100mM?Tris-HCl,pH?8.5，1.25M?NaCl，按體積在80℃孵育mRNA洗脫液2min，按體積比1:1加入磁珠結(jié)合緩沖液(1M?LiCl，40mM?Tris?HCl(pH?7.5)，2mM?EDTA，0.1％Triton?X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2?invitrogen)室溫下孵育5min后，吸棄上清液，

從磁力架上拿下，加入200ul磁珠清洗液(150mM?LiCl，20mM?Tris?HCl(pH?7.5)，1.0mM?EDTA，0.01％Triton?X-100)，放在磁力架上(DynaMag-2?invitrogen)室溫下孵育5min后，吸棄上清液，

加入25μL洗脫液((100mM?Tris-HCl,pH?8.5，1.25M?NaCl)，94℃孵育4min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟(2)的合成一鏈cDNA的方法為：

將步驟(1)獲得的17μL?mRNA在磁力架(DynaMag-2?invitrogen)靜置5min，取上清液，

按體積比4:1加一鏈合成混合液【50mM?Tris-Acetate，75mM?KOAc，3.1mM?Mg(OAc)2，0.5mM?dNTPs?each】4μL，按照8:1體積比加入0.1M?DTT【P/NY00147?invitrogen】2μL，按照16:1體積比10nMdNTP((P/NY00147?invitrogen】(1μL)進(jìn)行孵育37℃2min，

加入SuperScriptⅡ5μL，

孵育程序?yàn)椋?7℃60min，4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

步驟(3)的合成二鏈cDNA的方法為：

按體積比1:1向步驟(2)的一鏈cDNA體系中加入二鏈合成混合液30μL【20mM?Tris-HCl，12mM(NH4)2SO4，5mM?MgCl2，0.16mMβ-NAD，0.19mM?dNTPs?each】；E.coli?DNA?Ligase(10units/μL【P/NY01181?invitrogen】1μL、E.coli?DNA?Polymerase(10units/μL【P/NY0116?invitrogen】4μL、E.coli?RNase?H(2units/μL)1μL，

16℃孵育2h，加入純化磁珠90μL(_AMPure?_XP?_beads?A63881)，移液器混勻10次，室溫孵育15分鐘，放在磁力架5分鐘后，轉(zhuǎn)移上清液135μL，

按照體積比7:10在上清液中加入80％的乙醇，吸去上清，重復(fù)一次，室溫干燥15min，

加入52.5μL的重懸混合液(50mM?Tris-HCl,pH?8.0?10mM?EDTA)，

室溫孵育2分鐘，放置磁力架上5分鐘后轉(zhuǎn)移上清液。