[發明專利]攜帶qepA3新基因的質粒片段

在審

• 申請號: 201510415087.3
• 申請日: 2015-07-09
• 公開（公告）號: CN105039357A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 王冬國;陶國仙;阮桂英;陳佳玉
• 申請（專利權）人: 王冬國
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12N15/87;C12R1/19
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技術領域

本發明屬于分子生物學技術及耐藥細菌監測領域，涉及一段新發現的與大腸埃希菌耐藥性密切相關的質粒。

背景技術

大腸桿菌是醫學和獸醫臨床上最常見的病原菌之一，給人類的健康和畜牧業的發展造成了嚴重的損害。抗菌藥在控制大腸桿菌感染方面發揮了重要作用，但隨著抗菌藥物的廣泛應用，耐藥菌株迅速出現，多重耐藥現象十分普遍，特別是質粒介導的大腸桿菌引起的多重耐藥已成為威脅全球醫學及公共衛生的嚴重問題。

根據文獻報道，由質粒介導的喹諾酮類耐藥機制有：qnr基因因素、氨基糖苷類乙酰轉移酶aac(6’)-Ib-cr基因因素以及對喹諾酮類藥物敏感性降低的qepA和oqxAB外排泵基因等因素。qepA1基因首次在2007年被日本和比利時研究人員前后發現，接著，在2008年qepA2基因被法國研究人員發現，從此，qepA1和qepA2基因在世界各地普遍地被報道。雖然韓國研究人員披露在韓國qepA基因有很低的流行性，但我國研究人員發現在攜帶腸桿菌的食源性動物如豬、雞、鴨身上普遍發現qepA基因，這樣，潛在的qepA基因傳播和感染，甚至爆發具有極大地可能性，因此對qnr、aac(6’)-Ib-cr和qepA及oqxAB基因的檢測和監測也已經具有迫切的實際需要和意義。

從2008年發現qepA2基因至今，再也沒有其它的qepA等位基因發現。但是，在2013年9月，我們在浙江省臺州市立醫院一個ICU住院病人的血液中分離到攜帶qepA新等位基因的大腸埃希氏菌，經美國LaheyClinic的GeorgeA.Jacoby教授核實，將其命名為新qepA3新基因，GenBank登錄號JQ064560。同時進一步研究了qepA3所在質粒的長度及其qepA3上下游序列多個基因的結構，證明該菌株對抗生素多重耐藥原因是由于該菌株存在多種抗生素耐藥基因共同作用的結果。

發明內容

本發明提供了一段含有攜帶qepA3新基因及其上下游序列的質粒片段pEC3157，qepA3新基因的上下游序列中含有多種抗生素耐藥基因。質粒片段pEC3157的序列如SEQIDNO.1所示。該段質粒兩端含有縮短的tnpA(IS26)基因與縮短的tnpR基因、bla_CTX-M-14基因、rmtB基因、tnpA基因(ISCR3C)、qepA3新基因、dfr2基因片段和縮短的intI1-groEL融合基因連接。正是上述多種耐藥基因的表達，導致含有該段質粒的菌種對多種抗生素藥物具有耐藥性。這些抗生素包括：氨基糖苷類抗生素、β內酰胺類抗生素以及喹諾酮類抗生素耐藥。

常見的氨基糖苷類抗生素包括：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。

常見的β內酰胺類抗生素包括：青霉素、頭孢菌素，以及新發展的頭霉素類、單環β-內酰胺類等其他非典型β-內酰胺類抗生素。

常見的喹諾酮類抗生素抗生素包括：萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星。

本發明的質粒片段是通過以下方法獲得的：

(1)在臺州市立醫院ICU病人血液培養陽性的標本中分離出1株對頭孢曲松、阿米卡星、環丙沙星耐藥的細菌。

(2)將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK2和藥敏平板瓊脂擴散方法進行細菌鑒定及藥敏試驗，經鑒定此菌株為大腸埃希氏菌，將其命名為EC3157。同時，實驗證實此菌株對多種抗生素有顯著耐藥性。

(3)將EC3157菌株培養擴增，提取所述耐藥菌株的質粒。

(4)將步驟(3)提取純化后的質粒使用DraI和BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離分別得到兩段長度為4,567bp和6,198bp的DNA片段。將該兩DNA片段以常規方法分別與pMD19-T載體連接，然后熱激轉化法轉入感受態細胞E.coliTOP10中，以藍白斑實驗挑選陽性轉化子，分別測序。

(5)通過序列裝配組合，得到如SEQIDNO.1所示序列。