[發明專利]一種焦磷酸測序文庫的構建方法有效
| 申請號： | 201510414230.7 | 申請日： | 2015-07-15 |
| 公開（公告）號： | CN104962551A | 公開（公告）日： | 2015-10-07 |
| 發明（設計）人： | 高靜;蔡亦梅;徐瀟;吳超;張睿;王者馥;王緒敏;殷金龍;任魯風 | 申請（專利權）人： | 北京中科紫鑫科技有限責任公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 101111 北京市大興區經濟技術開發區科創六街*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 磷酸 序文 構建 方法 | ||
1.一種焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
樣品DNA提取及定量；
DNA片段化、純化及片段選擇：DNA片段化，進行目的片段的純化、回收，片段的定量和選擇；
末端補平，加A尾：對DNA進行末端補平，在3’端加A尾；
Y接頭連接：接頭包括正向接頭和反向接頭，正向接頭和反向接頭退火形成一個部分互補配對的Y型接頭；
在接頭上設計多個標簽，可以一次處理多個樣品；
小片段去除；
PCR?擴增，獲得擴增產物，即為雙鏈DNA文庫；
（8）?變性為單鏈，使雙鏈DNA文庫變為焦磷酸測序文庫。
2.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述回收為2.5%瓊脂糖凝膠電泳膠回收或Double?SPRI方法回收，優選為2.5%瓊脂糖凝膠電泳膠回收。
3.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述的標簽為96個。
4.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述定量使用Qubit熒光儀，定量檢測的標準為50μg/μl以上。
5.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述DNA片段化使用Covaris超聲波打斷儀。
6.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述目的片段的純化采用Qiagen?PCR純化試劑盒。
7.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述小片段去除使用磁珠純化法，磁珠純化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上。
8.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述PCR?擴增的擴增混合液中包含Mn2+和Mg2+，Mn2+的濃度為0.60-1.10?mmol/L，Mg2+的濃度為0.80-1.20mmol/L。
9.如權利要求1所述的焦磷酸測序文庫的構建方法，其特征在于，所述變性的溫度為93-95℃，時間為3分鐘以上，優選為3-5分鐘。
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