[發明專利]一種鉻?白蛋白螯合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510413563.8
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105004686B
• 公開（公告）日: 2018-01-05
• 發明（設計）人: 張積仁;陽帆;董欣敏;吳婧;蔡睿;孫遙;趙乙木
• 申請（專利權）人: 上海拜豪生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/53;G01N27/62;G01N1/28;G01N27/447
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種鉻-白蛋白螯合物，其特征在于，鉻離子與白蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成；

所述的鉻-白蛋白螯合物的制備方法，包括以下步驟：

A）鉻與白蛋白的螯合反應：在提純源于人體的白蛋白或按照生物學方法重組的白蛋白中加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶液；所述步驟A）具體如下：

1）透析袋的處理：將透析袋放入500ml的EDTA-NaHCO₃混合溶液中，煮沸10min；傾棄EDTA/NaHCO₃液，用超純水輕輕漂洗，再用500ml的 5mmol/L EDTA溶液煮沸10min；棄掉煮沸液，用超純水徹底清洗，加入超純水浸泡透析袋4℃過夜；使用時，戴上手套，取出透析袋，用超純水徹底沖洗其內外表面；

2）取2.0mg ITCBE溶于2ml DMSO中；

3）取4.0mg 白蛋白溶于4.0ml硼酸鹽緩沖溶液中；

4）緩慢將步驟2）配制的液體加入步驟3）配制的白蛋白溶液中，邊滴加邊震蕩，置于溫度為25℃，轉速為100r/min的搖床中反應24h，然后用透析袋透析24h，除去未與白蛋白結合的ITCBE；

5）將步驟4）所得的液體用1mol/L HCl調節pH值至7.0，然后緩慢逐漸滴加80μl的 1mmol/L 鉻離子溶液，邊滴加邊振蕩，以免鉻離子使蛋白變性沉淀；

6）將步驟5）所得的溶液置于溫度為25℃，轉速為100r/min的搖床中反應2h，用透析袋進行透析24h；

7）將步驟6）透析后的液體于-20℃分裝保存，得到反應溶液；

B）純化鉻-白蛋白螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應溶液中未反應的白蛋白以及多余的鉻離子，即得鉻-白蛋白螯合物；

所述步驟B）具體如下：

（1）溶解樣品：向經過步驟A）得到的反應溶液中加入生理鹽水使鉻-白蛋白螯合物復溶；

（2）平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與白蛋白特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱；

（3）上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1）中樣品，然后上柱，白蛋白與填料特異性結合；

（4）洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液Ⅰ；

（5）收集：收集洗脫液Ⅰ；

（6）透析：將步驟（5）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本；

（7）平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鉻特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；

（8）上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6）中樣本，然后上柱；

（9）洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液Ⅱ；

（10）收集：收集洗脫液Ⅱ；

（11）透析：將步驟（10）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本，即得鉻-白蛋白螯合物。

2.根據權利要求1所述的鉻-白蛋白螯合物，其特征在于，還包括步驟C）：對鉻-白蛋白螯合物的鑒定；

其中，步驟C）中具體如下：

（1）制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；

（2）加樣：取步驟B）中提取純化得到的鉻-白蛋白螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；

（3）電泳：連接電泳板，進行電泳；

（4）檢測：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。

3.一種如權利要求1所述的鉻-白蛋白螯合物在制備檢測血樣中鉻-白蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應用。

4.一種至少包括如權利要求1所述的鉻-白蛋白螯合物作為標準品的試劑盒。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲白蛋白的物質或捕獲鉻的物質。

6.一種定量檢測鉻-白蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權利要求1所述的鉻-白蛋白螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、酶聯免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純鉻-白蛋白螯合物與酶聯免疫結合法、提純鉻-白蛋白螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鉻-白蛋白螯合物與電感耦合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。