[發明專利]一種鎘?高密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510413246.6
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105044008B
• 公開（公告）日: 2018-01-05
• 發明（設計）人: 張積仁;陽帆;董欣敏;吳婧;蔡睿;孫遙;趙乙木
• 申請（專利權）人: 上海拜豪生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/53;G01N27/62;G01N1/28;G01N1/34;G01N27/447
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 湯喜友

1.一種鎘-高密度脂蛋白螯合物，其特征在于，該鎘-高密度脂蛋白螯合物是鎘離子與高密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成；

所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，包括以下步驟：

A）鎘-高密度脂蛋白的合成：在提純源于人體的高密度脂蛋白或按照生物學方法重組的高密度脂蛋白中加入鎘離子進行螯合反應，得到反應溶液；

具體操作步驟如下；

1）取2.0mg ITCBE溶于2mLDMSO中；

2）緩慢將步驟1）制備的液體加入高密度脂蛋白溶液中，邊滴加邊震蕩，于25℃，100r/min的搖床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未與高密度脂蛋白結合的ITCBE；

3）將透析所得的液體用1mol/L HCl調節pH值至7.0，然后緩慢逐漸滴加80μl 1mmol/L 鎘離子溶液，邊滴加邊振蕩，以免鎘離子使蛋白變性沉淀；

4）將加好的溶液在25℃，100r/min的搖床中反應2h，用處理好的透析袋進行透析24h；

5）將透析好的液體于-20℃分裝保存，得到鎘-高密度脂蛋白螯合物的反應溶液；

B）鎘-高密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A）反應溶液中未反應的高密度脂蛋白、特異性抗體和鎘離子，即得鎘-高密度脂蛋白螯合物；

所述步驟B）中具體包括以下步驟：

（1）溶解樣品：將上述步驟A）的提取的鎘-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中，得鎘-高密度脂蛋白螯合物溶液；

（2）平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與高密度脂蛋白特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱；

（3）上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1）所述溶液，然后上柱，使高密度脂蛋白與填料特異性結合；

（4）洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.05-0.10mol/L的Na₂HPO₄溶液進行洗脫；

（5）收集：收集步驟（4）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；

（6）透析：將步驟（5）中的收集的洗脫液裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本；

（7）平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鎘特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；

（8）上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6）中樣本，然后上柱；

（9）洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的Na₂HPO₄溶液進行洗脫；

（10）收集：收集步驟（9）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復原；

（11）透析：將步驟（10）的洗脫液裝透析袋，用ddH₂O透析除鹽，換水三次后，4℃透析過夜，收集樣本，即得鎘-高密度脂蛋白螯合物。

2.根據權利要求1所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物，其特征在于，步驟B）后還包括步驟C）：對鎘-高密度脂蛋白螯合物的鑒定；

其中，步驟C）中具體包括以下步驟：

（1）制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；

（2）加樣：取步驟B）中提取純化得到的鎘-高密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；

（3）電泳：連接電泳板，進行電泳；

（4）檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。

3.一種如權利要求1所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物在制備檢測血樣中鎘-高密度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應用。

4.一種至少包括如權利要求1所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物作為標準品的試劑盒。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲高密度脂蛋白的物質或捕獲金屬鎘的物質。

6.一種定量檢測鎘-高密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權利要求1所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、酶聯免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純鎘-高密度脂蛋白螯合物與酶聯免疫結合法、提純鎘-高密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鎘-高密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。