[發明專利]一種去除蛋白質中內毒素的方法

在審

• 申請號: 201510412140.4
• 申請日: 2015-07-14
• 公開（公告）號: CN105001299A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發明（設計）人: 張英;呂茂杰;楊保收;付旭彬;梁武
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 李明卓

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種去除蛋白質中內毒素的方法。

背景技術

內毒素是革蘭氏陰性菌菌體中存在的毒性物質的總稱，此類物質由菌體裂解后釋放，又稱為“熱原”。其化學成分有磷脂多糖-蛋白質復合物，其毒性成分主要為類脂質A。內毒素位于細胞壁的最外層、覆蓋于細胞壁的黏肽上。當細胞溶解、死亡或用人工方法破碎時，細菌內毒素釋放出來。內毒素一般以聚體形式存在，其磷酸基團與二價金屬離子螯合可進一步穩定內毒素分子間的聚合，促成更大的內毒素復合體，這類復合體的分子量可由幾千至數千萬不等。

內毒素不是蛋白質，因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。與外毒素不同之處在于：內毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素。少量內毒素即可引起機體發熱，嚴重的可引起微循環障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等。

隨著生物制品在醫藥領域中占的比例越來越大，內毒素的去除方法越來越多，工藝應用也越來越廣，內毒素去除工藝將具有更大的經濟效益與無窮的市場潛力。由于制品中的內毒素含量小而危害大，所以要求去除內毒素的方法具有高效、可靠及具有高度特異性，同時在去除過程中應保持制劑的本身性質及有效成分。目前，去除內毒素的方法主要有以下幾種：

(1)活性炭吸附法：活性炭吸附法是一種應用較早的去內毒素方法。但活性炭對各類不同成分的吸附作用研究尚不清楚，在吸附內毒素的同時會吸附部分有效成分。

(2)化學降解法：化學降解法是以強酸、強堿或氧化物等使內毒素降解的方法。這種方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，該方法的使用需結合產品的理化性質，蛋白質等產品不適用。

(3)層析法：包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析等。層析法選擇性差，由于內毒素在高鹽溶液中容易形成聚集體，往往需要多種不同的層析方法相結合才能達到去除內毒素的目的，而這將需要耗費大量時間。

(4)相分離法：此法操作簡單快速，但處理量小，并且中間有低溫到高溫的溫度變化，這對不穩定的蛋白質極為不利。此外，后續抽提試劑的去除也是一個問題。

(5)超濾：超濾是以壓力差為推動力的膜分離過程，可廣泛用于微粒的脫除，其中包括細菌、病毒、熱原和其他異物的去除。

隨著基因工程制品在生物醫藥領域所占的比例越來越大，而制品中內毒素含量小而危害大，去除內毒素的方法也越來越多。大部分的基因工程制品是蛋白類制品，蛋白性質不穩定、不耐熱、易失活，在內毒素去除過程中保證其本身性質及有效活性成分不受影響至關重要。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種去除蛋白質中內毒素的方法，以解決現有技術中存在的內毒素去除效率較低的技術問題。

本發明解決的另一技術問題是提供一種不影響蛋白質成分和性質的內毒素去除方法。

本發明解決的再一技術問題是提供一種降低蛋白質中內毒素去除工藝的成本。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種去除蛋白質中內毒素的方法，包括以下步驟：

1)對待處理樣品進行層析純化，收集目的蛋白；

2)取步驟1)得到的目的蛋白利用超濾膜包進行超濾，收集濾過液，其中膜包進口壓力為10～25psi，回流口壓力為4～6psi；

3)取步驟2)產物用0.22～0.45μm孔徑的濾膜過濾，收集濾過液。

優選的，步驟2)所述膜包中的膜面積與待處理樣品總量的比例不低于0.1ft²/L。

優選的，步驟2)用于超濾的加壓泵對每平方英尺膜面積其流量不低于1.2L/min。

優選的，步驟3)收集濾過液后，利用NaOH溶液或H₃PO₄溶液或NaCLO溶液或Tergazyme清洗劑或Henkel?P3-11清洗膜包；在此基礎上進一步優選的，所述NaOH溶液的濃度為0.1～0.5mM。

優選的，步驟2)所述膜包的截留分子量為100～1000KD。

優選的，步驟2)所述膜包的截留分子量為1～100KD。

優選的，步驟2)對目的蛋白超濾后，利用緩沖液繼續執行超濾3～5min，收集濾過的緩沖液與超濾后的目的蛋白混合，而后執行步驟3)。

優選的，步驟2)所述的超濾為切向流過濾。

優選的，步驟1)所述的層析是親和層析或離子交換層析或疏水層析或凝膠過濾層析。