[發(fā)明專利]用于河流弧菌LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列及引物和探針的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510411863.2
• 申請(qǐng)日: 2015-07-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105039541A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳炯;周前進(jìn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 何仲

1.一種用于河流弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列，其特征在于根據(jù)河流弧菌的外膜蛋白o(hù)mpU（GenBank登錄號(hào)：KC182592）的編碼序列設(shè)計(jì)LAMP的三對(duì)引物序列和一條探針序列，引物序列具體如下：

VflompU-F3：5’-TCATGGCTTACCACGGTA-3’

VflompU-B3：5’-GGTGTAAGACGCTGCTAG-3’，

VflompU-FIP：5’-AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3’，

VflompU-BIP：5’-TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3’，

VflompU-LF：5’-ACGGTAAGTTGCACGTAGAG-3’，

VflompU-LB：5’-GTGAAACTAGGTGCTGGCT-3’，VflompU-FIP的5’端為生物素標(biāo)記；

探針序列如下：VflompU-HP：5’-CTCTGATAACAAACAAGATGG-3’，5’端為異硫氰酸熒光素標(biāo)記。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列在河流弧菌LAMP-LFD可視化檢測(cè)方法中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的河流弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)方法，其特征在于具體檢測(cè)方法步驟如下：

1）配置LAMP反應(yīng)體系：反應(yīng)體系各成分的終濃度分別為：VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO₄6.5mmol/L，(NH4)₂SO₄10mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL樣品模版，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25μl；

2）LAMP反應(yīng)條件：將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為63℃，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為20min；

3）探針雜交和LFD檢測(cè)：擴(kuò)增后將20pmol的VflompU-HP探針加入反應(yīng)體系中，63℃溫育5min，進(jìn)行雜交，取5μL雜交液加入100μLbuffer中混勻，然后將LFD試紙條浸入加入雜交液的緩沖液中顯色，判斷橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)LAMP擴(kuò)增的結(jié)果。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針在制備河流弧菌LAMP-LFD可視化檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的河流弧菌LAMP-LFD可視化檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括LAMP反應(yīng)體系：反應(yīng)體系各成分的終濃度分別為VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO₄6.5mmol/L，(NH4)₂SO₄10mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL樣品模版，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25μl。