[發明專利]黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用

在審

• 申請號: 201510407814.1
• 申請日: 2015-07-10
• 公開（公告）號: CN105087612A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 高麗萍;趙賢倩
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 合肥順超知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 34120
• 代理人: 楊天嬌

技術領域

本發明涉及分子生物工程技術領域，尤其涉及的是一種黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用。

背景技術

植物中的黃酮類物質,屬于苯并吡喃環結構的一類天然化合物。它們多在苯并吡喃環母核的3-O,5-O，7-O，3’-O，4’-O等多羥基位點上與糖基團結合形成黃酮苷類物質。茶樹中的黃酮類主要為柚皮素(N)、山奈素(KC)，山奈酚(K)和芹菜素(A)，如圖1所示。

黃酮及黃酮苷類物質是茶葉多酚的重要組成成分,不僅是茶湯中澀味等品質成分物質,也是構成湯色色澤的重要因子。茶樹黃酮及其苷類具有多種生理功能如抗氧化等，是當今藥物和保健品熱門開發的對象。

黃酮醇糖基化在很多植物中主要發生在3或7-OH上，但是，在2004年Lim關于擬南芥糖基轉移酶的研究中發現，一些糖基轉移酶沒有嚴格區域選擇性，可以在槲皮素的3、7、3’,或4’位點糖苷化，在某些情況下,甚至形成少量的3,7二槲皮素糖苷和7,3’二槲皮素糖苷。而對山奈酚非特異性糖基化的研究只在2008年Markus的報道中發現：FaGT6和FaGT7糖基轉移酶基因主要形成3-O-山奈酚葡萄糖糖苷，少量的7-O-山奈酚葡萄糖糖苷和4’-O-山奈酚葡萄糖糖苷。并且FaGT6糖基轉移酶基因還能形成少量的一種二葡萄糖糖苷。而對茶樹中CsUGT73A20糖基轉移酶基因研究發現它不僅可以形成多位點山奈酚單葡萄糖糖苷，還可以非特異性形成多種多位點山奈酚二葡萄糖糖苷(山奈酚3，7-O-二葡萄糖糖苷，山奈酚3，4’-O-二葡萄糖糖苷和山奈酚7，3’-O-二葡萄糖糖苷)，如圖1所示。隨著反應時間延長，其中3,7-O-二葡萄糖糖苷產量增加顯著。迄今為止，茶樹中編碼依賴尿苷二磷酸葡萄糖的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因的功能還沒有得到驗證。本發明研究一種能編碼尿苷二磷酸葡萄糖依賴的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因，構建重組工程菌，提供一種生產多種黃酮醇葡萄糖苷的方法。

柚皮素苷、山奈素苷、山奈酚苷和芹菜素苷都是黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因的產物。有一些黃酮苷類物質如柚皮素苷、山奈素苷、部分山奈酚單糖苷可以商品化購買。但是還有一些黃酮苷類物質，如山奈酚雙氧葡萄糖苷，由于天然含量低純化難度大，至今沒有市場商品產物。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種從茶樹鮮葉中分離獲得的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用，以提供一種新的能夠編碼茶樹黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因及其編碼蛋白。利用本發明的重組工程菌，可以大量合成山奈酚雙氧葡萄糖苷，為山奈酚雙氧葡萄糖苷等多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成的工程化奠定基礎。

(二)技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：

一種黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因，該基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

優選的，所述的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因應用于多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成。

一種黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因的編碼蛋白，所述編碼蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

優選的，所述的編碼蛋白應用于多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成。

一種重組質粒，所述重組質粒含有所述黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

優選的，所述重組質粒為將黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因連接到pMal-c2X載體的多克隆位點中構建獲得，命名為pMal-c2X-CsUGT73A20。

一種轉基因工程菌，所述轉基因工程菌含有所述的重組質粒，或其基因組中整合有外源的所述的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因序列，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

優選的，所述轉基因工程菌為含有所述重組質粒的大腸桿菌Novablue(DE3)菌株，或其基因組中整合有所述黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因序列的大腸桿菌Novablue(DE3)菌株。

(三)有益效果