[發明專利]魚類總基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201510406907.2
• 申請日: 2015-07-13
• 公開（公告）號: CN105039308A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 毛慧玲;胡成鈺;方春林;萬正義;龔瑞玥;王芳
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京同澤專利事務所(特殊普通合伙) 32245
• 代理人: 蔣全強

技術領域

本發明涉及一種提取基因組DNA的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

魚類是最古老的脊椎動物。它們幾乎棲居于地球上所有的水生環境中。從淡水的湖泊、河流到咸水的大海和大洋。魚類是一種終年生活在水中，用鰓呼吸，用鰭輔助身體平衡與運動的變溫脊椎動物。目前全球已命名的魚種約在32100種。是脊椎動物亞門中最原始最低級的一群。魚肉富含蛋白質、鈣、磷、鐵、維生素B1、卵磷脂等多種營養物質，可增強記憶、思維和分析能力，延緩腦力衰退，因此對人類體力和智力的發展具有重大作用。魚肉適合多種烹飪手法，不僅滋味鮮美，而且易被人體消化吸收。除魚肉外魚的其他部分還可制成魚肝油、魚膠、魚粉等滋補品。獲取魚類總基因組DNA進行科學研究，對于進行魚類遺傳育種、資源評估等方面都具有重大的意義。獲取魚類總基因組DNA首先必須對魚類的DNA進行提取。

酚氯仿法是一種常用的DNA提取方法，通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質，通常是將處理好的樣本，分別加入細胞裂解液，蛋白酶K，苯酚，以及氯仿和異戊醇的混合液逐步進行處理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。苯酚可以使蛋白質變性，同時抑制DNase的降解作用。加入苯酚后,由于蛋白與DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿可以除去核酸溶液中的苯酚，加速有機相與液相分層。異戊醇可以降低表面張力，減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相和下層的有機溶劑相維持穩定。

目前，提取魚類總基因組DNA所用材料主要用的是魚類的血液，肌肉或魚鰭。這些提取材料在從魚類身上獲得時對魚類本身的傷害較大，很有可能會導致魚類死亡，從而使得一些后續的實驗特別是要將樣品魚進行繁殖的實驗無法進行。

魚鱗作為魚身體的一部分根據其外形，構造和發生特點，可分為楯鱗、硬鱗、圓鱗、櫛鱗四種類型。魚鱗的存在對于魚類的生存而言具有重要作用。第一，在魚類腹部的鱗片可以反射和折射亮光，如同鏡子一般，使水底下的兇猛水生動物眩目，產生水天一色之感，從而無法分辨魚類的存在，而魚類背部的魚鱗顏色較深，這與水底顏色相似，從而使水上的天敵無法分辨魚類的存在。第二，魚鱗為魚體提供了一道保護屏障，使魚類的身體與周圍含有無數微生物的環境隔離，從而有效地避免魚類感染疾病的幾率及提高了魚類抵抗疾病的能力。第三，魚鱗作為一層外部骨架，既可以使魚體保持一定的外型，此外，生物學家還可根據鱗片上環生的年輪，判斷魚的年齡，從而可以較為正確地掌握其生長、死亡率及健康狀況。第四、魚鱗上的粘液可以使魚體減少阻力，使天敵在捕捉時滑手，從而得以逃生。有些魚類如金魚、熱帶魚等，其體態多姿且鱗片色彩艷麗，因此具有較高的觀賞價值，深受人們喜愛。以魚鱗作為原料提取魚類總基因組DNA不會對魚類造成較大傷害，但因為魚鱗含有的細胞較少，基因組DNA含量較少，雜質較多一般不用做提取基因組DNA的實驗材料。如圖2所示，如果以魚鱗為原材料，采用酚氯仿法進行DNA的提取，提取的DNA含有雜質,且有非常嚴重的拖帶現象，無法滿足實驗的需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種試劑方便易取，提取DNA效果好，DNA完整度高的魚類總基因組DNA的提取方法。尤其可以以魚鱗為原材料進行提取，不受樣品量的限制。

本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種魚類總基因組DNA的提取方法，包括以下具體步驟：

A.取適量含有DNA的魚類組織，清凈粉碎后放入離心管中；

B.向離心管中加入適量的Chelex-100溶液，沸水浴15～20min；再加入適量的蛋白酶K溶液，50～60℃水浴3h以上；

C.吸取離心管中的液體置于另一個離心管中進行離心分離；

D.取上清液置于另一個離心管中，加入適量的RNase溶液，37℃水浴45min以上；

E.向離心管中加入適量的Tris飽和酚溶液，混勻后進行離心分離，并取上清液置于另一個離心管中；此步驟進行1～3次；

F.向離心管中加入適量的氯仿和異戊醇混合液，混勻后進行離心分離，并取上層溶液置于另一個離心管中；此步驟進行1～3次；氯仿和異戊醇混合液是氯仿與異戊醇按體積比為24:1混合而成；

G.向離心管中加入適量的乙醇溶液，4℃放置1h以上，使得DNA沉淀；

H.對離心管進行離心分離，棄上清液；

I.向離心管中加入適量的乙醇溶液，進行離心分離，棄上清液；此步驟進行1～3次；