[發明專利]一種中性植酸酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201510405422.1
• 申請日: 2015-07-10
• 公開（公告）號: CN104911160B
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 徐曉東;張霞;高云;崔潔;吳秀秀;王華明
• 申請（專利權）人: 青島瑪斯特生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/80;C12N1/15;A23K20/189;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體內容涉及一種中性植酸酶突變體及其在水產飼料中的應用。

技術背景

磷是魚類所必需的重要礦物元素之一，魚體對磷的需要量高于其他礦物元素但飼料中過量的磷被認為是造成水體富營養化的重要因素之一。因此，通過提高魚類對原料中磷的利用率，適當調整飼料中磷的含量，使其更接近魚的需要量，來降低養殖魚類磷的排放量，是減少水環境污染的重要途徑。

植酸酶作為一種由微生物發酵生產的酶制劑，可分解植酸和植酸鹽，促進飼料中植酸和植酸鹽的分解，使磷、磷酸根結合的內源性酶和其它營養素得以釋放和利用，減少糞磷對環境的污染，節省無機磷酸鹽的添加。多項研究證明，在水產養殖中植酸酶替代部分磷酸二氫鈣表現出了較好的養殖效果和環境效益。羅琳等(2007)在基本花鱸試驗研究表明用中性植酸酶部分替代磷酸二氫鈣是完全可行的，并得出中性植酸酶1000U/kg替代80％左右的磷酸二氫鈣綜合生長效果最佳，也證明中性植酸酶存在一定的廣譜應用性。近期研究還表明中性植酸酶在有胃和無胃水產動物均表現較好性能，可以在水產動物胃腸道中釋放大量的有效磷。

但當前市場上的植酸酶以酸性植酸酶為主，在pH 2.5和5.5條件下活性最高，而在無胃水產動物消化道中，由于沒有胃酸的分泌，消化道中pH約呈中性，不利于酸性植酸酶發揮作用。因此目前急需開發一種在中性pH范圍內具有較高酶活的植酸酶。

發明內容

本發明為解決現有技術問題，提供了一種中性植酸酶突變體及其應用。本發明通過隨機突變的方法對植酸酶PHYA進行改造，獲得一種突變體蛋白，其pH適用范圍更偏向中性條件，有利于其在水產飼料中的廣泛應用。

本發明一方面提供了一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1。

所述植酸酶的一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：2。

本發明另一方面提供了一種植酸酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO：1的植酸酶的第87位氨基酸由Ser變為Arg，第159位氨基酸由Gly變為Lys，第198位氨基酸由Ser變為Asp。

上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：3，其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID NO：4。

本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO：3的植酸酶突變體基因的質粒。

本發明再一方面提供了一種重組黑曲霉，是將上述質粒轉入黑曲霉中構建得到的。

本發明還提供了上述植酸酶突變體在水產飼料中應用。

本發明篩選到的植酸酶突變體PHYAT3最適反應pH為6.5，在pH6.5-7.0范圍內，能保持80％以上的酶活，當pH為8.0時，仍能保持20％的酶活，取得了意料不到的技術效果。與野生型相比，植酸酶突變體PHYAT3在中性范圍內的酶活水平得到顯著提高，最適反應溫度未發生明顯變化。所述植酸酶突變體可廣泛應用于水產飼料中，從而有利于減少飼料中無機磷酸鹽的添加，降低養殖成本，同時還能有效減少水產動物糞磷對環境的污染。

附圖說明

圖1為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相對酶活曲線圖；

圖2為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的溫度-相對酶活曲線圖。

具體實施方式

本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發明具體實施例的限定。

下面結合具體實施方式對本發明進行詳細描述。

實施例1 植酸酶基因的獲得

根據公共基因數據庫中的基因序列，優化了合成基因的密碼子并人工合成來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶基因PHYA(序列為SEQ ID NO：2)，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：1。

PCR引物和反應條件如下：