[發明專利]一種利用杏鮑菇廢菌糠制備固體漆酶的方法

在審

• 申請號: 201510399442.2
• 申請日: 2015-07-09
• 公開（公告）號: CN104974991A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 孫淑靜;單書凱;馮宏昌;陳文星
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于漆酶提取技術領域，具體涉及一種利用杏鮑菇廢菌糠制備固體漆酶的方法。

背景技術

漆酶具有廣泛的底物作用范圍，可以氧化降解包括單酚、鄰苯二酚、對二等多種酚類化合物及其衍生物，也可以氧化降解一些不含酚羥基的酚類類似物，還可以氧化降解一些有機磷毒物。因此，漆酶具有很多重要的生物學功能，尤其在紙漿生物漂白、廢水處理、環境污染物質去毒與降解方面顯示出較大的研究價值和應用潛力。而杏鮑菇是目前工廠化生產主要品種之一，是我國工廠化第二大產量的食用菌產品，年產量達13萬噸，杏鮑菇（Pleurotus?eryngii）在栽培過程中菌絲通過產生大量的木質素降解酶系降解栽培料的木質素及其纖維素，其中漆酶是木質素降解酶系關鍵酶之一，因此栽培后廢棄菌袋中富含有漆酶等多種胞外酶，工廠化栽培會產生大量的廢菌包，廢菌包來源穩定，為工廠化提取漆酶生產提供了穩定原料來源，在市場上有著巨大的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用杏鮑菇廢菌糠制備固體漆酶的方法，旨在為漆酶的應用提供更為科學的依據及低成本生產、穩定的來源。杏鮑菇廢菌糠提取的漆酶在多環芳烴生物修復方面有著廣闊的應用前景。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用杏鮑菇廢菌糠制備固體漆酶的方法：將杏鮑菇廢菌糠粉碎后，加入蒸餾水溶解，在24℃，pH自然，110?rpm搖床振蕩1h；4℃，8000?rpm離心15?min，取其上清液，采用冷丙酮沉淀，50mM?pH?6.0的磷酸緩沖液溶解，DEAE-sepharose陰離子交換柱層析，收集50?mM?pH?6.0磷酸緩沖液的洗脫液，冷凍干燥，得到固體漆酶。

粉碎速率28000?r/min，粉碎時間30s。

杏鮑菇廢菌糠與蒸餾水的質量體積比為1：10。

離心后的上清液與丙酮的體積比為1：1。

制得的固體漆酶的酶活為10220U/L，酶分子量為44.3kDa。

本發明的顯著優點在于：本發明旨在為漆酶的應用提供更為科學的依據及低成本生產、穩定的來源。杏鮑菇廢菌糠提取的漆酶在多環芳烴生物修復方面有著廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1是丙酮比例對漆酶沉淀率的影響。

圖2是DEAE-sepharose離子交換柱層析蛋白洗脫峰。

圖3是杏鮑菇漆酶的SDS-PAGE圖，A為蛋白Marker；B為純化后的漆酶蛋白；C為丙酮分級沉淀后的樣品。

圖4是漆酶最適溫度。

圖5是漆酶熱穩定性。

圖6是漆酶最適反應?pH。

圖7是漆酶?pH?穩定性。

具體實施方式

1?材料與方法

1.1?試劑

ABTS即2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)，購于SouthernBiotech公司，分析純。其他試劑均為分析純。

1.2?儀器

Adventurer^TM天平：AB204-E，奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；

實驗室超純水設備：WP-UP-111-20，四川沃特爾水處理設備有限公司；

恒溫振蕩搖瓶柜：HYG-A，太倉市實驗設備廠；

冷凍離心機：EppendorfCentrifuge5804R，上海富眾生物科學有限公司；

恒溫水浴箱：HS-6001，江蘇省杰瑞爾電器有限公司；

微波爐：PJZIC-BI，美的微波電器制造有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10，北京松源華興科技發展有限公司；

自動部份收集器：BS-100A-LCD，上海琪特分析儀器有限公司；

實驗室pH計:STARTER3C，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

紫外可見分光光度計：PHarmaciaBiotechultrospec2000；

雙垂直電泳儀：DYCZ-24EN型，北京六一儀器廠。

1.3?杏鮑菇采收后栽培料粗酶液的制備

將杏鮑菇采收后栽培料進行處理后，混勻，然后稱取10?g，加蒸餾水定容至100?mL，在24℃，pH自然，110?rpm的條件下，振蕩，1h；4℃，8000rpm離心15min，取其上清液，即為粗酶液，置于4℃冰箱保存備用。

1.4?漆酶酶活的測定