[發(fā)明專利]一種抗菌素及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510396965.1
• 申請日: 2015-07-07
• 公開（公告）號: CN105002240B
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉楊;劉黎玲;李夏云;肖湘
• 申請（專利權(quán)）人: 汕頭大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/315;C07K1/14;A61K38/16;A61P31/04
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭;張澤思

本發(fā)明涉及一種抗菌素及其制備方法與應(yīng)用，制備方法為：先將乳酸乳球菌ATCC 11454菌種活化后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，離心去除菌種得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液pH調(diào)至2后再利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再將pH調(diào)至初始值然后離心后取上清，過濾處理后得到發(fā)酵濃縮液；將發(fā)酵濃縮液與PBS緩沖液混合，再加入Triton X?114和MgSO₄構(gòu)成的雙水相體系，離心使雙水相達(dá)到相平衡后取上相，再用PBS緩沖液稀釋后制得含乳酸鏈球菌素和Triton X?114的抗菌素。本發(fā)明的抗菌素對革蘭氏陽性細(xì)菌有顯著的抑菌效果。本發(fā)明的抗菌素包含Nisin和Triton X?114，兩者的結(jié)合使得抗菌素具有較高的效價(jià)。本發(fā)明的提取工藝簡單、成本低，適用于間歇性和規(guī)模化生產(chǎn)加工高效價(jià)、高收率的抗菌素。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌素及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

Nisin亦稱乳酸鏈球菌素，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，是一種細(xì)菌抗菌肽，僅有34個(gè)氨基酸組成，分子量為3510Da左右，其活性分子常以二聚體和四聚體的形式存在。乳酸鏈球菌素由親水端和疏水端構(gòu)成，是典型的表面活性物質(zhì)。Nisin對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌均有抑制能力，產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌種對Nisin尤其敏感。在一般情況下，Nisin對革蘭氏陰性菌種、酵母和霉菌無抑制效果。因此被作為食品防腐劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。食用后在人體的生理pH條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其它抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會與其它抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，具有高效、無毒、無殘留、無耐藥性、耐酸、耐高溫、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，在生物飼料添加、食品防腐保鮮以及藥物治療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

目前Nisin的生產(chǎn)主要以乳酸乳球菌為生產(chǎn)菌，采用經(jīng)蛋白酶處理的巴氏滅菌奶和酵母膏作為培養(yǎng)基，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵、提取獲得。工業(yè)上常用的提取方法有有機(jī)溶劑法、吸附法、膜分離法和柱層析法。有機(jī)溶劑法是分離Nisin的經(jīng)典方法，操作簡便，但回收率低，產(chǎn)物活性低；吸附法能使產(chǎn)物保持較高的活性，但當(dāng)發(fā)酵液中的Nisin濃度超過細(xì)胞吸附能力時(shí)，只能回收部分Nisin，損失率較高；用膜分離法得到的產(chǎn)物純化效果不佳，雜質(zhì)較多；柱層析法能獲得較高純度的產(chǎn)物，但是處理量小，分離時(shí)間長。

這些分離純化工藝的不足導(dǎo)致Sigma公司生產(chǎn)的Nisin價(jià)格昂貴，純度只有2.5％；而國產(chǎn)的Nisin價(jià)格雖然不高，其效價(jià)、純度和穩(wěn)定性都非常低。這使得高效價(jià)、高純度Nisin的獲得及其廣泛應(yīng)用受到影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種抗菌素及其制備方法解決現(xiàn)有乳酸鏈球菌素生產(chǎn)時(shí)分離純化工藝的不足，價(jià)格昂貴，效價(jià)、純度和穩(wěn)定性都非常低等問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明的抗菌素的制備方法包括如下步驟：

步驟一，將乳酸乳球菌ATCC 11454菌種活化后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，離心處理后去除菌種，獲得乳酸乳球菌發(fā)酵液；

步驟二，將步驟一所得發(fā)酵液pH調(diào)至2以下，再利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再將pH調(diào)至初始值，然后離心處理后取上清，過濾處理后得到乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液；

步驟三，取步驟二所得發(fā)酵濃縮液與PBS緩沖液以重量比2:1混合，再加入TritonX-114和MgSO₄混合液構(gòu)成雙水相體系，離心處理使雙水相達(dá)到相平衡后取上相，再用PBS緩沖液稀釋后制得包含乳酸鏈球菌素和Triton X-114的抗菌素。

該方法通過乳酸乳球菌的培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和Triton X-114/MgSO₄雙水相體系萃取制得抗菌素，抗菌素中包含抗菌肽乳酸鏈球菌素和具有抑菌效果的表面活性劑TritonX-114，兩者的結(jié)合起協(xié)同作用使得抗菌素具有較高的效價(jià)。