[發明專利]一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO2生成速率的方法

有效

• 申請號: 201510379219.1
• 申請日: 2015-07-01
• 公開（公告）號: CN104977237B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 董宇平;陳笛笛;王煥;張亞會;石建兵;佟斌
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10
• 代理公司: 北京理工大學專利中心11120
• 代理人: 楊志兵,李愛英

技術領域

本發明涉及一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，屬于生物熒光標記與細胞生物學領域。

背景技術

細胞作為所有生物體內最小的功能和結構單元，其內部不停地進行著新陳代謝過程，而這一過程又與二氧化碳的循環密切相關。細胞內二氧化碳的含量在呼吸作用、核酸堿基對的形成、血液pH值的平衡、基因復制、細胞增殖及癌變等過程中起著至關重要的作用。細胞內各細胞器起著獨一無二的生理作用，如線粒體行使著呼吸作用、提供能量的中轉站，內質網負責運輸和貯藏蛋白質，高爾基體與細胞的分泌過程密切相關，而溶酶體則作為“消化車間”分解衰老損傷的細胞器、吞噬并殺死侵入細胞的病毒和病菌等。因此，原位檢測細胞內各細胞器中二氧化碳的生成速率對細胞器功能的深入研究、疾病的早期診斷和物種的進化有著十分重要的意義。

目前，大多數文獻已報道，在氣體混合物中檢測二氧化碳的含量，如大氣、海洋生態系統、天然氣的燃燒等。其中，電化學和紅外分析方法是兩種探測二氧化碳的最常見方法，然而這兩種方法由于對水較敏感而不適用于潮濕的環境下，因而更不能用于生物體系中二氧化碳的檢測。另外，熒光蛋白、無機量子點等作為一種新型的熒光探針近年來被廣泛用于活細胞成像，但由于對細胞的高毒性及對二氧化碳的無明顯響應等問題而無法用于原位檢測細胞內各細胞器新陳代謝的過程。(Cummins,E.P.；Selfridge,A.C.；Sporn,P.H.Sznajder,J.I.； Taylor,C.T.Cell Mol.Life Sci.,2014,71,831-845.Liu,Y.；Tang,Y.H.；Barashkov, N.N.；Irgibaeva,I.S.；Lam,J.W.Y.；Hu,R.R.；Birimzhanova,D.；Yu,Y.；Tang,B.Z. J.Am.Chem.Soc.,2010,132,13951-13953.Carballal,S.；Bartesaghi,S.；Radi,R. Biochimica et Biophysica Acta,2014,1840,768-780.Ali,R.；Lang,T.；Saleh,S.M.； Meier,R.J.；Wolfbeis,O.S.Anal.Chem.,2011,83,2846-2851.Guo,C.X.；Ng,S. R.；Khoo,S.Y.；Zheng,X.T.；Chen,P.；Li,C.M.Acs Nano.,2012,6,6944-6951. Waldrop,G.L.；Holden,H.M.；Maurice,M.S.Protein Science,2012,21,1597-1619. Guais,A.；Brand,G.；Jacquot,L.；Karrer,M.；Dukan,S.；Grevillot,G.；Molina,T.J.； Bonte,J.；Regnier,M.；Schwartz,L.Chem.Res.Toxicol.,2011,24,2061-2070)。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，所述方法采用一種含有4,4',4”-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯(TPP-TMAE)的熒光探針對活細胞各細胞器的新陳代謝過程進行檢測，所述熒光探針用于活細胞熒光成像的同時可原位定量檢測單個細胞內各細胞器二氧化碳的生成速率，并能有效甄別癌細胞和正常細胞。

本發明的目的由以下技術方案實現：

一種原位檢測單個活細胞內細胞器中CO₂生成速率的方法，所述方法具體步驟如下：

(1)將TPP-TMAE溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，得到濃度為1×10^-2mol/L 的溶液a；向溶液a中加入高糖DMEM培養基，得到濃度為1×10^-5mol/L的溶液b；

所述TPP-TMAE為4,4',4”-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基) 乙酯的簡寫，TPP-TMAE的結構式如下：

(2)將細胞器染料溶解于三蒸水中，得到濃度為1×10^-5mol/L的溶液c；