[發(fā)明專利]注射用結(jié)晶糜胰蛋白酶在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510377310.X | 申請日： | 2015-06-30 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN105087532A | 公開（公告）日： | 2015-11-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 俞水泉 | 申請（專利權(quán)）人： | 俞水泉 |
| 主分類號(hào)： | C12N9/76 | 分類號(hào)： | C12N9/76 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 215000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 注射 結(jié)晶 胰蛋白酶 | ||
一、技術(shù)領(lǐng)域
屬于生物提取技術(shù)。
二、背景技術(shù)
過去國內(nèi)外都是從牛胰中提取糜蛋白酶或胰蛋白酶。1976年吳縣制藥廠從豬胰中直接提取糜胰蛋白酶獲得成功。但1983年后，因原材料無法供應(yīng)，被迫停產(chǎn)。直到現(xiàn)在還是國際空白。
三、發(fā)明內(nèi)容
1、絞碎提取
取新鮮或冷凍豬胰，剝?nèi)ブ竞徒Y(jié)締組織后，用絞肉機(jī)絞碎，每10公斤加入予冷的0.2NH2SO4溶液20升(PH2-3.0)。攪拌(60轉(zhuǎn)/分)1小時(shí)后于室溫15-18℃下放置過夜，次日尼龍布(80目)過濾，濾渣再用0.5倍0.2NH2SO4溶液再提取一次，(1小時(shí))合并濾液，得抽提液。
2、分級(jí)鹽析
每10升抽提液在不斷攪拌下逐級(jí)加入工業(yè)用固體硫酸銨1.34公斤，使達(dá)0.25飽和度，并加入2％活性白土助慮，放置一天后過濾，每10升濾液再加工業(yè)用固體硫酸銨2.45公斤，使達(dá)0.65飽和度，放置過夜，次日過濾，得粗制濾餅。將此濾餅溶于5倍蒸餾水中，用固體硫酸銨重復(fù)上述步驟，取0.25-0.65飽和度沉淀部分，得精制濾餅。
3、透析、再鹽析
將上述精致濾餅溶于三倍體積蒸餾水中，在低溫下對0.01MPH5.5的醋酸鈉緩沖液透析二天(3-4小時(shí)換一次水)，過濾去沉淀。濾液加固體硫酸銨至0.65飽和度，得二次精制濾餅。
4、鹽析、去雜蛋白
將上述二次精制濾餅溶于三倍體積的冷蒸餾水中，調(diào)PH至3-3.5，加固體硫酸銨至0.25飽和度，室溫15-18℃放置3-5小時(shí)后，用0.5％活性炭助濾，然后在不斷攪拌下緩慢加入30℃左右的95％乙醇，使乙醇含量達(dá)10％濃度，24-25℃放置3小時(shí)后過濾，得得澄清濾液。濾液加固體硫酸銨至0.65飽和度，過濾得濾餅。然后再在0-10℃溫度下對0.01MPH5.5醋酸鈉緩沖液透析二天，過濾去除沉淀，濾液加固體硫酸銨至065飽和度，得透析濾餅。
5、結(jié)晶、重結(jié)晶
取上述透析濾餅溶于二倍體積的蒸餾水中，用5NH2SO4調(diào)PH至PH3.0，用醋洗滑石粉助濾，澄清濾液在不斷攪拌下緩慢加入0.31倍水體積的飽和硫酸銨溶液，用2NNaOH調(diào)至PH6.6，然后再加入少許飽和硫酸銨溶液至溶液略顯混濁為止，置26℃左右放置，二小時(shí)后即有結(jié)晶析出，次日收集沉淀，得晶體濾餅。按上述結(jié)晶操作程序，在(NH4)2SO0.25飽和度，PH6.0，0-5℃下緩慢重結(jié)晶一次，得重結(jié)晶濾餅。
6、透析沉淀
將重結(jié)晶濾餅對PH3-3.5的冰水透析脫鹽后，在低溫下緩慢加入95％冷乙醇(C.P)。使醇含量達(dá)到70％濃度，沉淀物過濾或離心，丙酮脫水三次后真空干燥，得結(jié)晶糜胰蛋白酶(注射用)。
四、具體實(shí)施方式
取新鮮或冷凍豬胰，剝?nèi)ブ竞徒Y(jié)締組織后，用絞肉機(jī)絞碎，每10公斤加入予冷的0.2NH2SO4溶液20升(PH2-3.0)。攪拌(60轉(zhuǎn)/分)1小時(shí)后于室溫15-18℃下放置過夜，次日尼龍布(80目)過濾，濾渣再用0.5倍0.2NH25O4溶液再提取一次，(1小時(shí))合并濾液，得抽提液。
每10升抽提液在不斷攪拌下逐級(jí)加入工業(yè)用固體硫酸銨1.34公斤，使達(dá)0.25飽和度，并加入2％活性白土助慮，放置一天后過濾，每10升濾液再加工業(yè)用固體硫酸銨2.45公斤，使達(dá)0.65飽和度，放置過夜，次日過濾，得粗制濾餅。將此濾餅溶于5倍蒸餾水中，用固體硫酸銨重復(fù)上述步驟，取0.25-0.65飽和度沉淀部分，得精制濾餅。
將上述精致濾餅溶于三倍體積蒸餾水中，在低溫下對0.01MPH5.5的醋酸鈉緩沖液透析二天(3-4小時(shí)換一次水)，過濾去沉淀。濾液加固體硫酸銨至0.65飽和度，得二次精制濾餅。
將上述二次精制濾餅溶于三倍體積的冷蒸餾水中，調(diào)PH至3-3.5，加固體硫酸銨至0.25飽和度，室溫15-18℃放置3-5小時(shí)后，用0.5％活性炭助濾，然后在不斷攪拌下緩慢加入30℃左右的95％乙醇，使乙醇含量達(dá)10％濃度，24-25℃放置3小時(shí)后過濾，得得澄清濾液。濾液加固體硫酸銨至0.65飽和度，過濾得濾餅。然后再在0-10℃溫度下對0.01MPH5.5醋酸鈉緩沖液透析二天，過濾去除沉淀，濾液加固體硫酸銨至065飽和度，得透析濾餅。
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