[發(fā)明專利]基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染BMSCs的組織工程骨構(gòu)建及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510375809.7
• 申請(qǐng)日: 2015-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104984397B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡楊;何惠宇;阿不力孜·阿布杜拉;崔杰;韓祥禎;張蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61L27/36;A61L27/12;A61L27/54
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種基因轉(zhuǎn)染 BMSCs 的組織工程骨，其特征在于，組織工程骨通過(guò)以下技術(shù)步驟獲得構(gòu)建：

(1) 構(gòu)建人 bFGF、BMP2、GFP重組慢病毒載體：分別構(gòu)建攜帶人bFGF、BMP2、GFP基因重組慢病毒載體，建立基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建人bFGF、BMP2、GFP-plenti6/V5-D-TOPO vector 表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)無(wú)移碼突變；在 Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體介導(dǎo)下，分別與三種包裝質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得 bFGF-重組慢病毒株，BMP2-重組慢病毒株，GFP-慢病毒病毒株；將三種病毒株感染羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用blasticidin篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)的 bFGF、BMP2和GFP基因的細(xì)胞株，經(jīng)Western-blot和倒置熒光顯微鏡檢測(cè)bFGF、BMP2 和GFP蛋白表達(dá)；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和ALP檢測(cè)，bFGF/BMP2基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染組BMSCs，非特異性成骨基因表達(dá)量較高，具備較好的成骨及成血管能力；研究結(jié)果證實(shí)人bFGF/BMP2 基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)BMSCs的成骨功能，初步探明 bFGF/BMP2 調(diào)控OPN和Collagen-Ⅰ成骨非特異性基因表達(dá)機(jī)制；

(2)人bFGF和BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs，GFP基因轉(zhuǎn)染BMSCs：將人bFGF、BMP2、GFP 基因重組慢病毒株，添加到成骨方向誘導(dǎo)的BMSCs 培養(yǎng)基中，通過(guò)抽取羊骨髓，進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)并行成骨誘導(dǎo)，RT-PCR 檢測(cè) BMSCs非特異性成骨基因 mRNA 水平表達(dá)，BMSCs 向成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中，骨橋蛋白、骨鈣素和Ⅰ型膠原在 mRNA 水平階段性表達(dá)，BMSCs成功向成骨細(xì)胞分化；經(jīng)Blasticidin 抗生素篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)目的基因的 BMSCs；

(3) 制備異種骨支架材料：選用成年羊脊椎骨，去除表面骨皮質(zhì)后切成 0.5cm×0.5cm×0.5cm 的立方體，采用體積分?jǐn)?shù) 30％ H₂O₂浸泡 12h 脫蛋白；經(jīng)甲醇/氯仿按照體積比1∶1浸泡12h 脫脂，處理重復(fù)3次，超聲震蕩儀清洗；干燥后，浸泡在0.09mol/L 焦磷酸鈉[Na₄P₂O₇.10H₂O] 溶液中，70℃恒溫水浴鍋溫浴12h，取出骨塊干燥，經(jīng)高溫煅燒工藝，在煅燒溫度達(dá)到 1000℃時(shí)維持 3h 煅燒后，采用碾磨的方法制備成骨粉，60Co 消毒、封裝制備出羊椎骨煅燒陶瓷骨粉，制備的羊椎骨煅燒陶瓷骨粉主要礦物晶相為羥基磷灰石和β-磷酸三鈣；采用經(jīng)過(guò)高溫微波煅燒工藝制備獲得羊椎骨煅燒陶瓷骨粉作為異種骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的異種骨支架材料，包括羥基磷灰石和β-磷酸三鈣構(gòu)成，該支架適宜作為 BMSCs 附著、生長(zhǎng)、增殖、代謝的微環(huán)境；

(4) 構(gòu)建GFP標(biāo)記的組織工程骨：將上述步驟(2)基因轉(zhuǎn)染的 BMSCs消化，計(jì)數(shù)，制備細(xì)胞懸液，將異種骨支架材料用培養(yǎng)基潤(rùn)濕，將細(xì)胞懸液接種到異種骨支架材料上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 24 小時(shí)，即制得 GFP 標(biāo)記的組織工程骨；將基因轉(zhuǎn)染的 BMSCs，細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，與異種生物骨支架材料支架共培養(yǎng)24小時(shí)后，成功構(gòu)建GFP標(biāo)記的組織工程骨。