[發(fā)明專(zhuān)利]調(diào)控基因dasR對(duì)紅色糖多孢菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510367102.1
• 申請(qǐng)日: 2015-06-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105039380B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉邦策;廖成衡;姚荔麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/74
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/74;C12N1/21;C12P19/62;C12P1/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海新天專(zhuān)利代理有限公司 31213
• 代理人: 龔敏

本發(fā)明涉及dasR基因?qū)t霉素生產(chǎn)菌紅色糖多孢菌在影響次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方法及其應(yīng)用；該方法包括如下步驟：敲除紅色糖多孢菌基因組中的dasR基因，得到突變工程菌；所述dasR基因的核苷酸序列為序列表中的序列。所述敲除dasR基因的得到的突變株或所述的突變株在影響次級(jí)代謝物產(chǎn)量中的應(yīng)用，所述次級(jí)代謝物具體為紅霉素和紅棕色色素。與未敲除的野生型菌株相比，dasR基因敲除工程菌株產(chǎn)生紅霉素和色素的量減少。說(shuō)明該基因與次級(jí)代謝物的產(chǎn)生正相關(guān)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及dasR基因?qū)t霉素生產(chǎn)菌紅色糖多孢菌在影響次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)是一種革蘭氏陽(yáng)性絲狀細(xì)菌，它最初被認(rèn)為屬于鏈霉菌屬，曾一度被稱(chēng)為“紅色鏈霉菌”(Streptomyces erythraeus)，但是后來(lái)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它其實(shí)是屬于糖多孢菌屬。

紅色糖多孢菌是紅霉素主要生產(chǎn)菌，而紅霉素主要用于殺死革蘭氏陽(yáng)性致病菌。這種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的廣譜抗生素自J.M.McGurie最初發(fā)現(xiàn)至今已逾六十年歷史。然而紅霉素因其高效的治療效果和使用的安全性至今仍然在醫(yī)藥界廣泛應(yīng)用。此后，人們對(duì)紅霉素A的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造并由此演變出豐富多樣更加有效的衍生物。這些半合成的第二代衍生物比如克拉霉素(Clarithromycin)和阿奇霉素(Azithromycin)和第三代衍生物酮內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥(ABT-773和HMR-3647)不僅具有更好的療效作用，也增加了紅霉素A作為初始原料的使用需求，從而推動(dòng)了整個(gè)紅霉素在醫(yī)藥市場(chǎng)的發(fā)展。

在早期，由于技術(shù)落后導(dǎo)致基因組序列信息的匱乏，使人們對(duì)于一些產(chǎn)抗生素放線(xiàn)菌的改造主要基于對(duì)野生菌的多輪的隨機(jī)誘變，進(jìn)而大量篩選得到高產(chǎn)的突變菌株，這種近乎暗箱操作的菌株優(yōu)化方法不僅耗時(shí)耗力且往往效率低下。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，2007年劍橋大學(xué)的研究者們完成了對(duì)紅色糖多孢菌野生株(S.erythraea NRRL23338)全基因組的測(cè)序工作，從而使人們對(duì)這個(gè)重要的工業(yè)放線(xiàn)菌的分子改造變得更加有的放矢。

通過(guò)基因工程改造紅色糖多孢菌以提高紅霉素產(chǎn)量有兩個(gè)策略：一是在對(duì)紅霉素合成生化途徑的了解的基礎(chǔ)上，通過(guò)理性改造紅霉素合成前體甲基丙二酰輔酶A(Methylmalonyl-CoA)的代謝流，二是在體內(nèi)高表達(dá)調(diào)控紅霉素合成基因簇的調(diào)控基因。而后者直接提出了對(duì)于抗生素合成調(diào)控相關(guān)基因的研究的緊迫性，這也是目前對(duì)于放線(xiàn)菌領(lǐng)域研究的重要部分。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)缺失紅色糖多孢菌dasR基因影響次級(jí)代謝物產(chǎn)量的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種調(diào)控基因dasR對(duì)紅色糖多孢菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方法，包括如下步驟：敲除紅色糖多孢菌基因組中的dasR基因，得到突變工程菌；

所述dasR基因的核苷酸序列為序列表中的序列。

上述方法中，所述敲除紅色糖多孢菌基因組中的dasR基因是通過(guò)雙交換同源重組基因敲除的方法，包括如下步驟：

1)在敲除質(zhì)粒pUC18-tsr的抗性基因tsr上下游接入預(yù)敲除基因dasR的上下約1500bp的同源臂序列，得到dasR基因缺失的pUC18-dasR質(zhì)粒；

2)將dasR基因缺失的質(zhì)粒通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到預(yù)先制備的紅色糖多孢菌野生株原生質(zhì)體中，得到dasR基因缺失的突變工程菌；

3)在含硫鏈絲菌肽抗性平板上篩選突變工程菌，并通過(guò)PCR和測(cè)序的方法驗(yàn)證突變菌。

所述紅色糖多孢菌為紅色糖多孢菌野生株NRRL23338。

本發(fā)明還提出了一種敲除dasR基因的得到的突變株或上述的突變株在影響次級(jí)代謝物產(chǎn)量中的應(yīng)用。