[發明專利]一種提高農桿菌介導的玉米遺傳轉化效率的方法

有效

• 申請號: 201510366609.5
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104911209B
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發明（設計）人: 劉亞;任雯;趙久然;徐游;李婷;周秒依;陳浩;楊鳳玲
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 北京京萬通知識產權代理有限公司11440
• 代理人: 齊曉靜

技術領域

本發明涉及一種提高農桿菌介導的玉米遺傳轉化效率的方法。

背景技術

1987年，Grimsley等^[25]將玉米條斑病毒的cDNA通過農桿菌介導法成功感染了玉米植株，首次證明了農桿菌可以侵染玉米；1991年Gould等^[26]通過農桿菌介導玉米莖尖分生組織的遺傳轉化獲得了陽性轉基因植株；1996年Ishida等^[12]用含超雙元載體的根癌農桿菌侵染玉米自交系A188的幼胚，得到5％-30％的轉化率，并獲得可育的玉米種子，這在農桿菌介導玉米遺傳轉化的研究歷程中具有十分重要的意義；2002年Frame等^[27]用普通雙元載體建立了一套穩定的農桿菌介導的玉米幼胚遺傳轉化系統，在同一時間，Zhao等^[3]也發表了類似的文章。農桿菌介導的玉米幼胚遺傳轉化體系的相繼建立，為農桿菌介導法的實際生產應用提供了充足的理論基礎和事實依據，為農桿菌介導法的進一步發展打下了堅實的基礎。

在目前的提高農桿菌介導的玉米遺傳轉化效率的方法中，一種是在38℃熱激較長的時間，另一種是在較高的42℃熱激較短的時間。具體步驟如下：

第一步：挑選長勢相似的已經授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸鈉溶液(內含1-2滴tween 20)滅菌20min，每隔5分鐘攪動一次。用無菌水沖洗2次后開始剝胚；

第二步：挑選1.0-1.5mm的白色略微有點透明幼胚，裝配到裝有無菌inf侵染培養基的1.5mL離心管里；

第三步：用無菌inf侵染培養基清洗幼胚2-3次；

第四步：熱激前吸干原先的inf侵染液，用已經預熱好的無菌inf侵染液(含有100mM的AS)加入離心管中，并立即水浴熱激；CK組常溫處理，不進行熱激；38度組放入38℃水浴熱激9分鐘；42度組42℃水浴熱激3分鐘；熱激后立刻冰浴1分鐘降低溫度；

第五步：用無菌inf侵染液(含有100mM的AS)重懸后的OD550＝0.3的菌液在20℃條件下侵染10min后吸干菌液盾片朝上擺到共培養培養基上；

共培養3天后可使用GUS染色等方法檢測侵染效率。將幼胚繼續誘導成的愈傷組織，培育成為轉基因植株。統計愈傷形成和獲得植株數據。

由后面的表2中可以看到，在38℃熱激9分鐘和在42℃熱激3分鐘均可顯著提高瞬時表達效率，但卻會同時大大降低愈傷組織誘導率，因此，盡管這兩種方法的轉化率較之室溫條件下的方法具有一定提高，但是由于愈傷組織誘導率的下降，最終導致轉化率提高有限。

發明內容

鑒于上述問題，本發明旨在提出一種能夠顯著提高轉化率的提高農桿菌介導的玉米遺傳轉化效率的方法。

本發明的提高農桿菌介導的玉米遺傳轉化效率的方法包括以下步驟：第一步：挑選長勢相似的已經授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸鈉溶液滅菌20分鐘，每隔5分鐘攪動一次；用無菌水沖洗2次后開始剝胚；其中，所述次氯酸鈉溶液含有1-2滴tween 20；第二步：挑選1.0-1.5mm的白色透明幼胚，裝配到裝有無菌inf侵染培養基的1.5mL離心管里；第三步：用所述無菌inf侵染培養基清洗幼胚2-3次；第四步：分別預熱兩管熱激液，第一熱激液預熱溫度為38℃，第二熱激液預熱為42℃，并準備冰浴條件；第五步：吸干所述離心管里的述無菌inf侵染培養基后，用所述的已經預熱好的38℃無菌的第一熱激液加入離心管中，并將所述離心管立即放入38℃水浴熱激8分鐘；第六步：隨后立刻將帶有所述幼胚的離心管放入冰浴中，冰浴3分鐘后取出，重新加入無菌inf侵染培養基沖洗；第七步：再次吸干所述離心管里的所述無菌inf侵染培養基后，將所述的已經預熱好的42℃無菌的第二熱激液加入到所述離心管中，并立即放入42℃水浴熱激1分30秒；第八步：將水浴溫度調至20℃，使含有所述幼胚的第二熱激液自然降溫至20℃后，吸干離心管中的液體；第九步：在所述離心管中加入用無菌inf侵染培養基重懸后的OD550＝0.3的菌液，在20℃條件下侵染20分鐘后吸干所述菌液，盾片朝上將所述幼胚擺到共培養培養基上，共培養3天。

優選地，所述第一熱激液包含1g/L的NH4Cl、0.34g/L的MgSO4、150mg/L的KCl、10mg/L的CaCL2、3mg/L的FeSO4、0.5mol/L的NaH2PO4、20g/L的蔗糖、19.52g/L的MES、200μmol/L的AS、100mg/L的SM；