[發明專利]一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 201510366448.X
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104962572A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 鄭宗林;黃朝芳;王廣軍
• 申請（專利權）人: 鄭宗林;黃朝芳
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C07K14/195;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 王昌貴

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法。

背景技術

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛存在于自然界的淡水、污水和土壤中，通過污染的水和相關產品感染人類。臨床癥狀表現為胃腸炎，皮膚和軟組織感染，也是淡水養殖較為嚴重的病原菌之一。會導致魚類的出血性敗血癥、積水、潰瘍、無癥狀敗血癥和眼球突出等。此菌存在有多種血清型，隨地域和宿主的不同而有所差異，限制了滅活疫苗的使用范圍。解決此問題的關鍵在于找出嗜水氣單胞菌的共同保護性抗原，以制備對不同血清型菌株均有保護作用的疫苗。外膜蛋白(outer?membrane?protein，OMP)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。它鑲嵌于細菌外膜的中間，在維持細菌外膜結構、物質轉運方面發揮著重要作用。有許多研究結果表明，細菌的主要外膜蛋白的免疫原性很強，是重要的保護性抗原，ompA蛋白族是革蘭氏陰性菌外膜中的主要成分并且是保守的，其主要作用是維持外膜的完整。缺少ompA和胞壁脂蛋白的細菌變異株其形態為球形，細胞膜也不穩定。健康的動物具有抵抗病原微生物的侵襲和感染的能力，機體可依靠皮膚、粘膜、血腦等屏障結構阻止病原微生物的進入，還可通過組織和體液中的抗微生物物質如補體、溶菌酶、干擾素等進行抑菌、殺菌或溶菌，機體這一系列的免疫反應限制或抵制了細菌的復制。因此，病原菌的致病作用必須能夠逃避或適應宿主的防御，許多研究已證實，某些細菌的OMP在細菌致病過程中起著重要的作用。用SDS-PAGE分析了致禽敗血癥的大腸埃希氏菌OMP，發現禽大腸埃希氏菌非致病或表現很髙LD₅₀的菌株都缺乏僅在致病菌株中才有的40.7和28.8KD的2種主要蛋白亞單位，說明這2種蛋白可能在禽敗血癥的致病過程中起作用，因此，利用致病菌的OMP做免疫原可使魚免受產生對不同血清型菌株感染的交叉保護力。

魚類的非特異性防御機制可以分為體液防御和細胞防御兩種方式，并且這兩種方式都是先天形成的，沒有特異性能，作用于所有的外來病原微生物、也無遺傳性和記憶性。其中溶菌酶、補體和巨噬細胞呼吸暴發活性是評價魚類非特異性免疫防御的重要指標。

由此可見，能否利用嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因進行原核表達從而制備一種蛋白，使其可作為對魚具有保護作用的疫苗，成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。

發明內容

本發明為了解決上述技術問題，提供一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法。

本發明的技術方案包括：

一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白，所述的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1，所述的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2。

一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的應用，所述的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白可作為抗原在制備預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑中使用。

所述預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑還包括弗式不完全佐劑。

所述弗式不完全佐劑同所述嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白體積比為1:1。

一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的應用，所述的預防嗜水氣單胞菌的疫苗制劑的制備方法包括以下步驟：在無菌注射器中加入制備好的嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白，用移液器向所述無菌注射器中加入等體積的弗式不完全佐劑，乳化5min后，用注射器反復推進，直至水相與油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色液滴，即制成疫苗制劑。

一種嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因原核表達蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：嗜水氣單胞菌基因組DNA提取及嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因的克??；從嗜水氣單胞菌分離株提取基因組DNA，根據嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因序列設計特異性引物，進行PCR擴增反應，將得到的PCR擴增產物純化后，以載體和插入片段物質的量之比1：3的比例克隆入pMD18-T載體，在含氨芐青霉素的LB平板上挑取陽性克隆，經雙酶切和PCR鑒定后，獲得陽性克隆提取質粒DNA；