[發明專利]一種耐高溫海藻糖合酶及其表達基因與應用

有效

• 申請號: 201510363951.X
• 申請日: 2015-06-26
• 公開（公告）號: CN104946610B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 蘇靜;王瑞明;李珍珍;張云霄
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/18;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種耐高溫海藻糖合酶及其表達基因與應用，特別涉及一種惡臭假單胞菌海藻糖合酶經過定向改造后獲得的耐高溫海藻糖合酶及其表達基因與應用，屬于生物技術技術領域。

背景技術

海藻糖(Trehalose)是一種由兩個吡喃環葡萄糖分子經α-1,1-糖苷鍵連接構成的非還原性二糖，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內。研究表明，其性質穩定，對生物體具有非常重要的生物學意義。主要表現在它是生物體能源和碳源的儲備物，是蛋白質和生物膜分子在脫水、高溫、氧自由基、低溫等惡劣環境中的穩定劑和保護劑，是信號傳感復合物和生長調控因子，而且還是某些細菌細胞壁的組分之一，因此在科學界海藻糖有“生命之糖”的美譽。海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優良活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料。因此海藻糖可廣泛的應用到醫藥、化妝品業以及食品行業，具有誘人的開發應用前景和巨大的經濟效益。

鑒于海藻糖廣泛而重要的應用價值，尋找海藻糖高效方便、低成本生產方法的研究被廣泛重視。目前海藻糖的生產方法主要有酵母提取法、發酵法、酶合成法。其中酶法生產海藻糖具有較高的特異性和快速溫和等特點，已經成為研發海藻糖工業化生產的熱點并作為短期可見效的可行性途徑之一。

海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalose synthase,TreS)是一種分子內葡糖苷轉移酶它只需要一步反應就可以將麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉化為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖。該酶反應流程短，易調控，不需要消耗高能物質，不需要磷酸鹽共存，只需要一種酶一步反應就能獲得海藻糖，因此海藻糖合酶轉化法是適宜工業化生產海藻糖的方法，有著良好的應用前景，受到廣泛的關注。到目前為止，國內外有報道的能夠產海藻糖合酶的微生物已經超過15種。不同微生物來源的海藻糖合酶的催化效率、酶學性質各有不同，但具有基本共同點：一是底物轉化率較低，最高只有80％左右，一般為60％-70％；二是酶的熱穩定性較差，最適反應溫度為25℃左右；三是反應時間太長，一般為48小時，有的長達72h。

發明內容

針對現有技術的不足，提供一種耐高溫海藻糖合酶及其表達基因與應用，耐高溫海藻糖合酶為通過對惡臭假單胞菌海藻糖合酶進行定向改造后獲得。

本發明技術方案如下：

一種耐高溫海藻糖合酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一種耐高溫海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

該耐高溫海藻糖合酶在現有惡臭假單胞菌海藻糖合酶的基礎上，根據模擬三維結構，通過分子生物學手段將N端和C端蛋白質柔性區域進行截取，保留蛋白質穩定結構域N42-C680得到。改造后的海藻糖合酶通過大腸桿菌原核高效表達后，利用親和層析，離子交換層析，分子篩層析等一系列純化手段，最終獲得。該海藻糖合酶與原始的海藻糖合酶(KT2440)相比其表達量有所提高，熱穩定性也明顯提高。

一種重組載體，在質粒中插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

根據本發明優選的，所述質粒為pET-15b載體質粒。

一種轉基因細胞系，宿主細胞內轉化有上述重組載體。

根據本發明優選的，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21DE(3)。

上述改造后海藻糖合酶的表達基因、重組載體或轉基因細胞系在制備海藻糖合酶中的應用。

上述海藻糖合酶在制備海藻糖中的應用。

本發明所述的海藻糖合酶，由惡臭假單胞菌海藻糖合酶(Pseudomonas putida KT2440)經過分子改造獲得。具體方法為：根據惡臭假單胞菌海藻糖合酶三維結構模擬，利用PCR的方法，設計引物將其三維結構中的柔性區進行截取，獲得海藻糖合酶穩定結構域的基因。將該基因連接到pET-15b載體上構建成質粒，并轉化到大腸桿菌BL21DE(3)中進行原核表達。然后通過鎳柱親和層析，Source-Q離子交換層析，Superdex-200分子篩層析的方法分離獲得高純度的海藻糖合酶。

有益效果