[發明專利]鑒定節瓜枯萎病的方法及引物對的應用

有效

• 申請號: 201510363654.5
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN105002167B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 喬燕春;林錦英;李光光;謝偉平;謝麗芳;李兆龍
• 申請（專利權）人: 廣州市農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙)32257
• 代理人: 李廣

技術領域

本發明涉及分子生物學DNA標記檢測技術領域，尤其是用于節瓜枯萎病鑒定的SRAP分子標記引物及其方法和應用。

背景技術

節瓜又名毛瓜，屬葫蘆科一年生攀援草本植物，是冬瓜的一個變種，是華南地區重要蔬菜作物之一。

枯萎病由真菌或細菌引致的植物病害，發病突然，癥狀包括嚴重的點斑、凋萎或葉、花、果、莖或整株植物的死亡。生長迅速的幼嫩組織常被侵襲。

瓜類枯萎病又稱萎蔫病，由半知菌亞門尖鐮孢屬尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)引起，它以產生的絮狀菌絲侵入植物體，成熟后產生大量鐮刀狀分生孢子和蝗卵狀分生孢子進行傳播侵染(安重瑩等，2009)，傳播速度之快、傳播范圍之廣，毀滅性之大，損失之大，危害難以控制；并且根據文獻報道(佘小漫等，2011)，瓜類枯萎病菌至少存在8個專化型，即尖孢鐮刀菌西瓜專化型〔F.oxyspoorum Schl.f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen〕、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.cucumerinum Owen)、尖孢鐮刀菌甜瓜專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.melonis Snyder&Hansen)、尖孢鐮刀菌葫蘆專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.lagenariae Matuo&Yamamoto)、尖孢鐮刀菌冬瓜專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.benincasae Sun S.K.&Huang J.W.)、尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.momodicase Sun&Huang)、尖孢鐮刀菌絲瓜專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.luffae Kwai Suzuki&Kawai)和尖孢鐮刀菌瓜類專化型(F.oxyspoorum Schl.f.sp.cucurbitacearum Gerlagh M.&Block W.J.)，而各專化型對瓜類作物的致病性存在明顯差異，只要了解了瓜類作物屬于哪一種專化型，就有對應的防御和治療措施，但這8個專化型中并沒有尖孢鐮刀菌節瓜專化型，所以對節瓜開展抗枯萎病分子標記研究，對于疫情的發生進行提前預測，顯得尤為重要。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

針對目前生產上利用生物防治和化學防治并不能從根本上了解發病原因，從根本上了解致病特性，本發明提供一種可以對節瓜枯萎病進行早期診斷，及時、快速、準確預警節瓜枯萎病發生的鑒定方法。

本發明首先提供一種SRAP分子標記，所述的分子標記是用于鑒定節瓜枯萎病。

進一步的，所述的分子標記為引物對。

本發明另外一個目的是提供一種引物對，所述的引物對是從所述的SRAP分子標記上篩選的，用于鑒定節瓜枯萎病。

本發明的第三個目的是提供一種用于鑒定節瓜枯萎病的SRAP分子標記的特異性擴增引物對，所述反向引物的核苷酸序列數量為11對大于正向引物的核苷酸序列數量9對。

進一步的，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列選自下述組合之一：em9me8，em7me6，em2me5，em10me5，em5me1，em1me5，具體的引物序列表如表1所示；

進一步的，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列為em5me1的組合，分別如SEQ ID No.1和No.14所示。

以上所述的特異性擴增引物對在鑒定節瓜枯萎病方面的應用。

本發明的第四個目的在于提供采用SRAP分子標記技術鑒定節瓜枯萎病的方法，采用前面所述em5me1引物對，用PCR擴增體系擴增節瓜枯萎病的基因組DNA，將所得PCR產物進行電泳檢測，若PCR擴增產物中出現309bp的特征帶，則所鑒定的節瓜感染有枯萎病。

其中，優選的，所述PCR擴增體系為25ul，PCR-buffer是2.5ul，Mg²⁺是2.0ul，dNTPs是0.5ul，tTaq DNA聚合酶是0.3ul，DNA是4ul，引物對是2ul，H₂O是13.7ul；